引言
在現代生物醫學研究中，了解人類基因變異對複雜疾病的影響是一個關鍵的挑戰。多能幹細胞（human pluripotent stem cells，hPS細胞）因其能夠分化為多種細胞類型的特性，成為研究人類生物學的重要模型。近來，技術進步使得大規模hPS細胞研究成為可能，這為探索分子表型的遺傳調控及其對人類疾病的貢獻提供了新途徑。通過結合單細胞測序技術，研究人員可以在細胞發育或實驗操作過程中，識别依賴于特定環境的遺傳效應。hPS細胞，包括胚胎幹細胞（embryonic stem cells，ES細胞）和誘導多能幹細胞（induced pluripotent stem cells，iPS細胞），在生物學研究中具有重要地位。iPS細胞通過重新程式設計體細胞（如皮膚細胞或血細胞），表達特定的多能性轉錄因子（如OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC），獲得類似于ES細胞的基因表達和表觀遺傳狀态。這使得每個hPS細胞都攜帶捐贈者的基因組，成為研究人類表型和疾病遺傳驅動因素的理想工具。傳統上，hPS細胞主要用于研究由少數基因座決定的罕見疾病。然而，複雜疾病（如帕金森病、青光眼和心血管疾病）通常由多個遺傳變異和環境因素共同決定，hPS細胞在這方面的應用相對較少。盡管全基因組關聯研究（GWAS）已識别出許多與複雜疾病相關的基因座，但超過90%的基因座位于基因間區，可能通過改變基因組調控發揮作用。更複雜的是，越來越多的證據表明，許多基因座的效應依賴于細胞類型或特定環境條件。盡管hPS細胞在研究基因調控方面的應用尚處于初期階段，已有研究表明其具有強大的潛力。例如，hPS細胞已被用于發現非編碼調控突變的效應、預測藥物毒性以及開發細胞替代療法。然而，大多數研究僅基于少數捐贈者的細胞系，這限制了研究結果的廣泛适用性。在實際操作中，進行大規模hPS細胞實驗存在許多挑戰，如細胞系之間的變異、細胞培養和分化的複雜性以及實驗成本。幸運的是，幹細胞庫（如HipSci和iPSCORE）和自動化細胞處理技術的發展，已在一定程度上克服了這些限制，使得使用hPS細胞進行創新性群體基因組學研究成為可能。5月13日Nature Genetics的文章“Integrating population genetics, stem cell biology and cellular genomics to study complex human diseases”探讨了幹細胞生物學、群體遺傳學和細胞基因組學的整合如何有助于解析人類基因變異的功能後果，并探讨了将這些領域結合起來所面臨的關鍵挑戰及其解決方法。強調了兩個人類生物學領域，特别是在揭示複雜疾病風險位點機制和評估常見遺傳變異與藥物治療表型關系方面，hPS細胞研究的潛在巨大益處。随着技術的進步和研究的深入，期待在解析遺傳變異如何影響疾病表型和藥物反應方面取得重大進展，進而改善醫學結果。
hPS細胞在生物醫學研究中的應用多能幹細胞的種類與特點人類多能幹細胞（hPS細胞）包括兩種主要類型：胚胎幹細胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）和誘導多能幹細胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）。ESCs來源于早期胚胎内細胞團，具有自我更新和分化成任何體細胞類型的能力。而iPSCs則通過體細胞重程式設計技術産生，通過在體細胞中強制表達多能性轉錄因子如OCT3/4、SOX2、KLF4和MYC，使其恢複到多能狀态。iPSCs與ESCs在基因表達譜和表觀遺傳狀态上高度相似，具備幾乎相同的多能性特征。這意味着iPSCs能夠在體外分化成各種類型的體細胞，包括神經細胞、心肌細胞、肝細胞等。是以，hPS細胞被廣泛用于模拟人類發育過程、研究疾病機制和篩選潛在藥物。
體細胞重程式設計與iPSCs生成iPSCs的生成過程通常包括以下幾個步驟：體細胞選擇：從供體身上擷取體細胞樣本，例如皮膚成纖維細胞或血細胞。轉基因導入：利用病毒載體或其他方法，将多能性轉錄因子基因（如OCT3/4、SOX2、KLF4和MYC）導入體細胞中。多能性誘導：在特定培養條件下，通過多能性轉錄因子的表達，使體細胞重新程式設計為多能狀态，形成iPSCs。iPSCs篩選和擴增：從培養中篩選出成功重程式設計的細胞群體，進一步擴增以供研究使用。
hPS細胞在遺傳研究中的應用由于hPS細胞包含供體的完整遺傳資訊，研究人員可以利用這些細胞研究遺傳變異如何影響人類表型。例如，通過将來自不同個體的iPSCs進行分化，觀察不同基因型對細胞發育和功能的影響，可以深入了解疾病的遺傳基礎和個體差異。
疾病模型的建構hPS細胞特别适用于建構各種疾病的體外模型，尤其是那些難以在體内直接研究的疾病。例如，研究人員可以通過将hPS細胞分化成神經細胞來研究神經退行性疾病如阿爾茨海默病或帕金森病的病理機制。此外，利用iPSCs生成心肌細胞，可以研究心髒病的發病機制，并篩選潛在的治療藥物。
藥物篩選與毒性測試hPS細胞在藥物篩選和毒性測試中也發揮着重要作用。通過将hPS細胞分化為特定的目标細胞類型，如肝細胞或心肌細胞，研究人員可以在體外評估新藥的療效和安全性。例如，通過測試藥物在iPSCs衍生的心肌細胞中的作用，可以預測藥物對心髒的潛在毒性，減少臨床試驗中的風險。
帕金森病（Parkinson's Disease）中的應用帕金森病是一種複雜的神經退行性疾病，其病因涉及多種遺傳和環境因素。研究人員利用iPSCs從帕金森病患者的體細胞生成多能幹細胞，再将其分化為多巴胺能神經元，通過觀察這些神經元的功能缺陷和基因表達變化，揭示帕金森病的病理機制。例如，通過基因編輯技術修正患者iPSCs中的特定突變基因，可以進一步驗證這些基因在疾病中的作用，并探索潛在的基因療法。
心髒病（Cardiovascular Disease）中的應用心髒病是另一類常見的複雜疾病，其風險因素包括多種基因變異和生活方式因素。研究人員利用來自不同個體的iPSCs生成心肌細胞，通過比較不同基因型對心肌細胞功能的影響，發現某些基因變異可能會增加心髒病的風險。此外，利用這些心肌細胞進行藥物篩選，可以識别對特定基因型患者最有效的藥物，提高個體化治療的效果。
人類多能幹細胞（hPS）細胞系池的實驗設計（Credit: Nature Genetics）
複雜疾病的研究現狀hPS細胞在罕見疾病研究中的應用hPS細胞，特别是iPSCs，已經在研究罕見遺傳疾病中發揮了重要作用。這些疾病通常由少數基因突變引起，這些突變通常位于編碼蛋白質的基因區域内。例如，Duchenne型肌營養不良症（Duchenne Muscular Dystrophy, DMD）是一種由DMD基因突變引起的遺傳疾病，通過從患者體細胞中生成iPSCs并将其分化為肌肉細胞，研究人員可以觀察這些細胞的功能缺陷，進而深入了解疾病的分子機制。此外，通過基因編輯技術，如CRISPR-Cas9，研究人員還可以修複這些突變，進而驗證其在疾病中的作用，并探索潛在的基因療法。
複雜疾病的挑戰與罕見疾病不同，複雜疾病的風險因素更加多樣，涉及多種遺傳變異和環境因素。例如，帕金森病、青光眼和心血管疾病等複雜疾病的風險并非由單一基因突變決定，而是由許多基因變異的累積效應和環境因素共同作用。全基因組關聯研究（Genome-Wide Association Studies, GWAS）已經識别出許多與這些複雜疾病相關的基因位點，但超過90%的位點位于基因間區域，這些區域通常不編碼蛋白質，而是通過調控基因表達來發揮作用。
群體規模的hPS細胞研究為了更好地了解複雜疾病的遺傳機制，研究人員正在利用群體規模的hPS細胞研究。這些研究涉及從大量個體中生成iPSCs，并對其進行基因組測序和分子表型分析。通過這種方法，研究人員可以探讨遺傳變異在不同細胞類型和發育階段中的作用。研究人員利用來自不同帕金森病患者和健康個體的iPSCs，生成多巴胺能神經元，通過比較這些神經元的功能和基因表達，揭示疾病相關基因的作用。例如，LRRK2基因的突變被認為是帕金森病的重要風險因素，通過iPSCs模型，研究人員發現該基因的突變會導緻多巴胺能神經元的功能異常，進而增加帕金森病的風險。
通過将來自不同個體的iPSCs分化為心肌細胞，研究人員可以觀察不同基因型對心肌細胞功能的影響。例如，通過研究某些基因變異如何影響心肌細胞對藥物的反應，研究人員可以開發出更個性化的治療方案。此外，通過比較不同個體的iPSCs心肌細胞，研究人員還發現了一些新的心血管疾病風險基因，例如PCSK9基因的變異與高膽固醇水準和心血管疾病風險增加相關。
動态QTLs：識别特定狀态下的遺傳效應動态表達數量性狀位點（dynamic expression quantitative trait loci，動态eQTLs）是研究遺傳效應在不同細胞狀态（如藥物暴露）下如何變化的方法。與傳統QTL研究不同，傳統QTL研究通常測試特定情況下的“靜态”遺傳效應，而動态QTL模型能夠增加分辨率，識别隐藏的效應。例如，一個遺傳效應可能隻有在細胞暴露于藥物時才存在 。
動态QTLs的應用動态QTLs特别适用于檢測在特定細胞狀态下（如分化過程中）出現的瞬态效應。通過在多個時間點采樣細胞并使用動态QTL模型，可以識别遺傳效應如何随細胞發育譜系變化。例如，在hPS細胞分化過程中采樣細胞并應用動态QTL模型，可以揭示基因組表型在細胞發育不同階段的遺傳效應 。
心肌細胞分化中的動态QTLs在心肌細胞分化過程中，研究人員利用單細胞RNA測序技術揭示了動态基因調控。例如，研究發現rs11124033對FHL2基因表達的效應在心肌細胞分化過程中呈現線性變化，而rs28818910對C15orf39基因表達的效應則表現出非線性變化。這些發現揭示了遺傳變異在細胞狀态轉變過程中對基因表達的不同影響 。
内胚層分化中的動态QTLs在内胚層分化過程中，THUMPD1基因的表達水準随着細胞狀态的變化而變化。具體來說，當細胞處于多能狀态時，THUMPD1的表達水準較高且存在顯著的等位基因效應（标記為eSNP rs76148084[G/A]）。然而，當細胞向内胚層狀态分化時，THUMPD1的整體表達水準下降，等位基因效應也随之減弱。另一個例子是VAT1L基因的表達在中胚層發育階段表現出差異等位基因效應（标記為eSNP rs7191422[T/A]），這種效應僅在細胞處于中間發育階段時觀察到，表明攜帶T等位基因的個體在發育過程中表達水準下降更快 。
動态QTLs的優勢動态QTLs方法提供了研究基因型（G）和細胞狀态（C）互相作用（G×C）的工具，這些細胞狀态可以是暴露于刺激物或藥物。通過結合單細胞測序資料，動态QTLs可以在連續的細胞狀态軌迹中測試，如細胞分化過程中，每個細胞即使同時采集也會處于稍微不同的狀态（例如，細胞成熟度）。這種方法的優勢在于能夠更精确地放置細胞在細胞狀态景觀中，進而改善動态遺傳效應的檢測 。
目前，識别動态QTLs的方法剛剛興起，結果表明這些位點通常位于未知調控注釋的區域。這些位點可能在發育軌迹的相關中間時間點上具有之前未被認識到的調控效應，未來可以通過進一步的功能驗證來表征。hPS細胞實驗的規模将從數十條細胞系擴大到數千條細胞系，且對總體成本和實驗設計的影響較小。随着hPS細胞、群體遺傳學方法和細胞基因組學的交叉融合，期待這些研究能夠為人類基因組學的發現和轉化提供寶貴工具 。
單細胞基因組學的優勢提高分辨率單細胞測序技術相對于傳統的“批量”方法具有明顯的優勢，能夠提高檢測人類遺傳變異對表型影響的分辨率。傳統的批量方法在研究中測量的是細胞群體的平均表型，而單細胞測序技術則能夠對個體細胞進行分析，進而揭示細胞之間的異質性和潛在的遺傳變異效應。
個體細胞分析單細胞測序的進步使得研究人員能夠對個體細胞在異質細胞群中的讀數進行研究和表征。這種方法允許研究人員更深入地了解細胞群體内部的異質性，特别是在譜系分化和三維類器官模型等複雜細胞系統中。
譜系分化中的單細胞基因組學在hPS細胞譜系分化過程中，單細胞基因組學的應用使得研究人員能夠跟蹤單個細胞的表型變化。通過分析單個細胞的基因表達和表型，可以了解細胞在分化過程中的轉錄動态，揭示基因表達調控網絡的複雜性。
三維類器官模型中的單細胞基因組學在建構三維類器官模型時，單細胞基因組學的應用使得研究人員能夠對組織内部不同細胞類型的分布和功能進行詳細研究。通過分析單個細胞的基因表達和表型，可以識别組織中不同細胞群體的特征，并揭示其在組織功能中的作用。
随着單細胞測序技術的不斷發展和完善，可以預見，單細胞基因組學在生物醫學研究中的應用将會越來越廣泛。未來，可以利用單細胞技術更加全面地了解細胞的功能和調控機制，進而為疾病的診斷和治療提供更加精準和有效的方法。
将遺傳學和幹細胞整合用于藥理基因組學和藥物開發遺傳變異對藥物反應的影響遺傳變異在患者對治療藥物的反應中起着關鍵作用。已有研究表明，具有遺傳證據支援的藥物療法成功推向市場的可能性是其他療法的兩倍。這意味着了解患者的遺傳背景可以幫助醫生更好地選擇治療方案，并最大程度地提高治療的有效性和安全性。
hPS細胞在藥物開發中的應用臨床前藥物開發階段hPS細胞及其衍生的細胞，包括組織和類器官系統，已經被廣泛用于臨床前藥物開發階段。通過利用不同類型的hPS細胞，研究人員可以模拟人體内不同組織的反應，進而評估藥物的療效和毒性。例如，通過将藥物暴露于hPS細胞衍生的心肌細胞中，可以評估藥物對心髒功能的影響；而将藥物暴露于肝髒組織模型中，則可以評估其代謝和毒性效應。
區分有希望的化合物和可能失敗的化合物利用hPS細胞模型，研究人員可以區分有希望的化合物和可能在臨床試驗中失敗的化合物。通過評估藥物在不同細胞類型中的效應，研究人員可以更準确地預測其在患者身上的效果。這有助于篩選出最有前景的藥物候選物，并在早期階段排除潛在的失敗者，進而節省時間和資源。
檢測細胞毒性效應除了評估藥物的療效外，hPS細胞模型還可以用于檢測藥物的細胞毒性效應。通過暴露hPS細胞或其衍生的細胞模型于候選藥物，研究人員可以評估藥物對細胞生存和功能的影響。這有助于發現潛在的毒性效應，并在臨床試驗之前進行及時幹預和調整。
心髒病藥物開發中的應用在心髒病藥物開發中，利用hPS細胞模型可以評估候選藥物對心髒功能的影響。通過将藥物暴露于hPS細胞衍生的心肌細胞中，可以評估其對心肌收縮和舒張的影響，進而預測藥物對心髒的療效和安全性。
肝髒毒性篩選中的應用在藥物開發過程中，肝髒毒性是一個常見的問題。利用hPS細胞衍生的肝細胞模型，研究人員可以評估候選藥物對肝髒功能的影響，進而預測其潛在的肝毒性效應，并及早發現和解決這些問題。
随着對hPS細胞的研究不斷深入，可以預見其在藥物開發中的應用将會越來越廣泛。未來，随着技術的不斷進步，可以期待更加精确和高效的藥物開發過程，為患者提供更安全、更有效的治療方案。
hPS細胞實驗的挑戰細胞類型成熟度和精确細胞注釋在單細胞hPS細胞基因組研究中，正确分類和量化細胞狀态至關重要。然而，hPS細胞具有多種分化潛能，是以在分化過程中可能存在多種細胞類型的混合。為了克服這一挑戰，研究人員需要開發更精确的細胞分類方法，并結合單細胞轉錄組學資料進行細胞狀态的準确注釋。
多樣性和可擴充性hPS細胞的多樣性和可擴充性是進行群體基因組學研究時需要考慮的重要因素。由于個體之間的遺傳差異和細胞分化的不确定性，研究人員需要確定在實驗設計中考慮到這些因素，以確定結果的可靠性和泛化能力。
擴大實驗規模的挑戰技術穩定性的影響在擴大hPS細胞實驗規模時，技術穩定性（如批次效應）可能會對實驗結果産生影響。為了減少這種影響，研究人員需要采取措施來标準化實驗流程和條件，并使用統一的品質控制标準來確定資料的可比性和可靠性。
hPS細胞池的設計為了克服技術變異的影響，并在不增加時間和成本的情況下包含更多細胞系，研究人員提出了使用hPS細胞池的方法。這種方法涉及在一個培養皿中同時培養和分化多個hPS細胞系，進而減少實驗之間的技術變異，并提高實驗的可重複性和可比性。
hPS細胞作為一種細胞模型，在評估人類遺傳變異對不同譜系、發育狀态和細胞類型的影響方面顯示出巨大的潛力。這些細胞模型提供了友善、可擴充的平台進行實驗驗證，特别是在人類發育過程中再現人類的細胞模型。盡管hPS細胞的維護和分化在實驗時間和成本上有限制，但技術進步使得使用hPS細胞模型進行群體基因組學研究成為可能。
為了準确确定遺傳變異如何影響細胞功能，需要測試基因型-細胞狀态（genotype-by-context，G×C）互相作用的統計方法。預計，hPS細胞實驗的規模将從數十條細胞系擴大到數千條細胞系，且對總體成本和實驗設計的影響較小。随着hPS細胞、群體遺傳學方法和細胞基因組學的交叉融合，期待這些研究能夠為人類基因組學的發現和轉化提供寶貴工具。
原文連結
Farbehi N, Neavin DR, Cuomo ASE, Studer L, MacArthur DG, Powell JE. Integrating population genetics, stem cell biology and cellular genomics to study complex human diseases. Nat Genet. 2024 May;56(5):758-766. doi: 10.1038/s41588-024-01731-9. Epub 2024 May 13. PMID: 38741017.
https://www.nature.com/articles/s41588-024-01731-9
責編|探索君
排版|探索君
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