題目：Analysis of Single-Cell RNA-Seq Identifies Cell-Cell Communication Associated with Tumor Characteristics
摘要
惡性良性腫瘤生态系統由多種細胞類型組成，通過配體-受體互相作用進行通信。靶向配體-受體互相作用（例如，與免疫檢查點抑制劑的互相作用）能對患者提供巨大的好處。然而，我們對于哪一個互作發生在惡性良性腫瘤中以及這些互作如何影響預後了解的仍然不夠。我們提出了一種通過使用單細胞RNA測序在微環境中跨所有細胞類型的配體-受體互相作用表征通信的方法。我們用這個方法去識别和比較出現在六個合成的小鼠惡性良性腫瘤模型中的配體受體互作。為了識别可能與預後相關的互作，我們将互作對表型生長率的表型做回歸分析。除此之外，我們用人類黑色素瘤資料來量化T細胞亞群之間的配體-受體互相作用及其與免疫浸潤的關系。總體而言，這種方法為研究細胞間互相作用，它們在惡性良性腫瘤中的變異性以及它們與預後的關系提供了一種工具。
背景
結果
1.對合成的小鼠模型進行單細胞RNA-seq測序
合成的小鼠模型通常用于研究惡性良性腫瘤的免疫治療。然而，關于配體受體互作不同的模型仍然存在不完全的了解。我們對6個小鼠惡性良性腫瘤模型（每個惡性良性腫瘤模型兩個樣本）進行單細胞測序。共5種癌症類型。因為一些模型很少被免疫細胞浸潤，我們額外富集了CD45陽性細胞。CD45是白細胞共同抗原，廣泛存在于白細胞表面。根據T細胞表達的CD45分子的類别不同，可将人類T細胞分為CD45RA+初始T細胞和CD45RO+記憶T細胞。值得注意的是，被測細胞頻率在分類群體和未分類群體之間有很好的相關性(決定系數[R2]=0.73，p=5.63107，圖A)，主要差異僅在免疫細胞浸潤不良的B16-F10模型。
總共，獲得了超過10000個細胞的mRNA(557 for B16- F10 cells, 4,479 from CT26 cells, 780 from EMT6 cells, 1,677 from LL2 cells, 1,310 from MC-38 cells, and 1,670 from Sa1N cells) The average num ber of reads per cell was approximately 72,000, and a median of approximately 2,500 genes was detected per cell .
為了檢查我們的scRNA-seq測量是否反映蛋白質豐度，我們将同一惡性良性腫瘤的單細胞懸液與抗體平行染色，并分析 流式細胞儀分離的蛋白質标記的表達。将單細胞測序技術與流式細胞分選技術相比較，發現二者得到的單細胞的頻率是相關的，如下圖A。除此之外，我們還計算了5種免疫細胞的頻率，發現這兩種方法還是有很強的相關性A（圖B）。
這些資料共同表明，scRNA-seq的測量重新記錄了流式細胞儀測量的細胞類型豐度和标記表達
2、 基于小鼠惡性良性腫瘤模型scRNA-Seq資料的細胞類型分類
這小節提出了一個新的方法劃分細胞類型。
為了識别細胞之間的互作，首先要将細胞劃分類型。由于scRNA-seq技術的局限性，如m RNA捕獲效率，收集的資料包含未檢測到的基因。 這種現象被統稱為“zero dropout”，使得基于單個标記基因的細胞類型的識别對于資料集中的所有細胞都是不可行的。 是以，我們改進了一種先前發表的有監督分類方法來配置設定細胞類型。 我們首先手動定義一個細胞類型清單，用于在資料集中搜尋，然後指定定義每個細胞類型的标記基因。如下表
為了判斷每個細胞對每個marker是positive還是negative，我們拟合了高斯混合模型對每個marker基因的表達值，然後為為每個資料集中的細胞配置設定一個混合成分。我們測試這個高斯模型包含1到5個成分來允許多模型基因表達的可能性的發生。然而，。 然而，在所有情況下，除了一個(Rpl29)，包含兩個成分的混合模型最适合使用貝葉斯資訊準則(B IC)作為模型選擇的度量的基因表達譜。
在我們将每個标記基因的細胞标記為陽性或陰性後，我們建立了一個高置信度細胞的訓練資料集，該資料集與單個細胞類型的指定标記基因圖譜相比對 .以這種方式，我們從不同的模型中識别出了惡性良性腫瘤細胞、免疫細胞（13 B cells, 62 cancer-assosciated fifibroblasts [CAFs], 21 endothelial cells, 495 macrophages, 23 natural killer [NK] cells, 142 T cells, and 55 dendritic cells [DCs]）和基質細胞。訓練集資料包含2/3的細胞。 這個訓練資料集是保守的，因為受零辍學影響的細胞被排除在外。于是乎我們用這個訓練集資料去訓練一個有監督的決策樹分類器，去預測剩下的細胞的細胞類型。
為了避免過拟合，我們隻用了前500個變異基因然後做了主成分分析對輸入資料降維。（主成分覆寫95%）這使得分類器更魯棒對dropout資料和噪音資料。用5倍交叉驗證驗證分類器的準确性。
用這個分類器，我們預測了細胞的細胞類型。 我們還計算了每個細胞被配置設定指定标簽的機率，隻保留了具有95%以上機率的細胞。平均每個模型有6%的細胞沒有被配置設定标簽。
在聚類的過程中，巨噬細胞有點不一樣，小鼠同基因模型中的單個細胞按惡性細胞模型和非惡性細胞的細胞類型聚類(圖1A和1B)，但巨噬細胞除外。 巨噬細胞表現出依賴于組織背景的可塑性，惡性良性腫瘤模型對巨噬細胞的聚類可能是由于惡性良性腫瘤的微環境不同所緻。 此外，巨噬細胞似乎也根據小鼠的菌株分離。下圖為巨噬細胞在不同模型和不同小鼠種族的聚類圖
非CD45富集樣品中已鑒定細胞群體的頻率因模型而異，說明免疫浸潤對不同惡性良性腫瘤的衆所周知的變異性。在免疫群體中，巨噬細胞是所有模型中最豐富的免疫細胞類型，占免疫細胞的80%-95%。。 所有惡性良性腫瘤模型均顯示T細胞浸潤，T細胞約占免疫細胞的2%-12%，這取決于惡性良性腫瘤模型 。 在B16-F10和Sa1N模型中，NK細胞的百分比從不到1%的免疫細胞變化到LL2模型中的大約5%。在六種惡性良性腫瘤模型中的四種中檢測到B細胞，占總免疫細胞的1%-2%。 最後，DCs是最稀有的免疫細胞群體，并被檢測到 在Sa1N惡性良性腫瘤模型中。
3、 利用已知配體-受體互相作用的細胞細胞間作用
定義了細胞類型，然後我們量化了惡性良性腫瘤微環境中所有細胞類型之間潛在的細胞-細胞互相作用。我們用了一個1800對已知的或者文獻挖掘的互作， 其中包含趨化因子、細胞因子、受體酪氨酸激酶(RT K)和惡性良性腫瘤的受體配體互相作用 壞死因子(TN F)家族與細胞外基質(ECM)-整合素互相作用。此外，我們還加入了已知的B7家族成員的互作，因為它們和癌症的免疫治療有關。
為了确定在六種同基因惡性良性腫瘤模型中保守的潛在的細胞-細胞互相作用，我們篩選了每個惡性良性腫瘤模型，以确定給定配體-受體互相作用的兩個成員的情況 由惡性良性腫瘤微環境中存在的細胞類型表示。我們計算了平均配體表達和平均受體表達，将二者相乘得到一個互作分值，計算了每個惡性良性腫瘤模型的互作得分之後，我們又将6個模型的互作得分計算均值，以此來識别保守的互作。 考慮到細胞-細胞互相作用的數量，我們篩選了(大約1500對配體受體對轉換為小鼠同系物[人類到小鼠同系物轉換]和64對組合。 細胞類型)，我們還使用單邊Wilcoxon秩和檢驗評估了每個互相作用評分的統計意義，并進行了Benjamini-Hochberg多重假設校正。
雖然我們計算了所有已識别的細胞類型的互相作用，但我們選擇強調CAFs或巨噬細胞分泌配體的互相作用，因為這些細胞類型是許多配體的主要來源。此外，我們檢查了所有涉及惡性良性腫瘤細胞的互相作用。
許多高互作得分的互作是趨化因子家族。趨化因子互作經常涉及到相同的受體，包括Ccr1, Ccr2, Ccr5，和它們呢都共享配體，包括Ccl2, Ccl4, and Ccl12.。盡管趨化因子配體主要被巨噬細胞表達，而趨化因子和細胞因子配體廣泛的被T細胞，B細胞，巨噬細胞和NK細胞表達。除了趨化因子外，我們還觀察到許多與細胞外基質有關的互相作用。CAFs分泌多種ECM成分，包括膠原(如Col1a1和Col1a2)和纖維連接配接蛋白(Fn1)，它們與整合素受體(如Itgb1和Itga5)和CD4等粘附受體結合 ，在所有細胞中廣泛表達。 我們還觀察到金屬肽酶(MMPs)、金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)、崩解素和金屬蛋白酶(ADAMS)的分泌， 它們都參與調節惡性良性腫瘤的細胞外環境。
觀察到許多得分最高的互相作用涉及到共同的配體和受體，這表明我們的度量所得分很高的互相作用可能主要是由配體受體中的一個所驅動的。 是以，我們研究了細胞類型特異性受體和配體在所有互相作用中的表達。
我們首先計算了所有配體-受體互相作用的配體表達、受體表達和互相作用評分(圖S3D)之間的成對相關性。配體表達和受體表達均與互相作用評分（中位數相關性分别為0.26和0.35）密切相關。 此外，檢查配體表達、受體表達和互相作用評分之間的關系(圖S3E)表明，一般情況下，隻有當 配體和受體都高表達時，才會發生強的互相作用評分。
4、 細胞-細胞互相作用分數與感興趣表型的關聯
接下來分析細胞互作與表型之間的關聯，也就是對生物體的影響。
接下來，我們想讨論如何利用互相作用分數來獲得對相關生物表型感興趣的預測洞察力（例如，惡性良性腫瘤生長或抗惡性良性腫瘤免疫反應）。 在沒有治療條件的情況下，我們将每個惡性良性腫瘤模型的惡性良性腫瘤生長速率作為感興趣的表型。 然後，我們計算了所有六種惡性良性腫瘤模型的互相作用分數與惡性良性腫瘤生長速率之間的Spearman相關性。由于我們專注于惡性良性腫瘤生長速度，我們隻顯示了涉及惡性良性腫瘤細胞的互相作用，盡管非惡性良性腫瘤細胞之間的互相作用也是相關的。
我們觀察到許多ECM相關的互相作用與惡性良性腫瘤生長呈正相關。我們還觀察到許多與惡性良性腫瘤生長速率相關的趨化因子和細胞因子互相作用。 惡性良性腫瘤細胞既分泌表皮生長因子(E GF)又表達Erbb3受體的自分泌互相作用與惡性良性腫瘤生長呈正相關。 此外，分泌血小闆衍生生長因子(PDGFC和PDGFD)的CAFs與與PD GFF結合的血管内皮生長因子(VEGF)(Vegfa和Vegfc)配體之間的互相作用 惡性良性腫瘤細胞上的Pdgfrb和VEGF受體與惡性良性腫瘤生長速率呈正相關。
這小節主要分析了圖C中與惡性良性腫瘤生長成正相關或負相關的互作，并沒有詳細的解釋生物學意義。
一般來說，我們觀察到許多與特定表型密切相關的互相作用包含相同的受體但是是不同的配體。 然而，也有許多情況下，互相作用評分與惡性良性腫瘤生長速率密切相關，但受體和配體都沒有強烈相關。是以，我們單獨計算了配體或者受體與惡性良性腫瘤生長速率的相關。 我們觀察到與表型高度相關的互相作用評分通常要麼具有較高的受體相關性，要麼具有較高的配體相關性。 這一結果并不是意料之外的，因為互相作用分數是受體表達和配體表達的産物，是以不是獨立的。 然而，也有許多情況下，互相作用評分與惡性良性腫瘤生長速率密切相關，但受體和配體都沒有強烈相關。 此外，我們還觀察到受體表達和配體表達具有相反的強相關性（圖的左上和右下區域）的情況，這 表明互相作用分數相關并不僅僅反映配體和受體的相關性。
5、 定量分析人類轉移性黑色素瘤的互相作用
接下來，我們将我們的方法用于定量細胞間的互相作用，用于已發表的人類轉移性黑色素瘤資料集 。 我們采用同樣的分類方法來識别細胞類型，并使用Tirosh等人識别的标記量化細胞類型百分比。 （2016）
此外，我們選擇了預測為T細胞的細胞，并再次應用了我們的方法 進一步将細胞分類為CD8細胞、T輔助細胞或調節性T細胞。 鑒于T細胞在惡性良性腫瘤微環境中的複雜互相作用及其在成功免疫治療反應中的重要性，我們研究了Tregs的互相作用。我們發現有許多互作涉及到趨化因子家族的成員。和以前的發現一樣，大量的趨化因子的互作共享相同的配體，包括由B細胞，巨噬細胞以及T細胞亞組分泌的CCL3，CCL4，CCL5。 此外，我們還觀察到細胞因子互相作用，分别涉及IL10和IL15配體以及IL10RA和IL2RG受體。 由于Tregs的免疫抑制作用，我們也 挖掘B7家族互相作用的個體惡性良性腫瘤，Tregs表達配體，CD8T細胞表達受體 。 我們觀察到許多抑制互相作用的表達，包括CD274(PD-L1)-PDCD1(PD-1)、CTLA4-CD80和CTLA4-CD86互相作用。然而，盡管這些B7互相作用平均發生在所有黑色素瘤樣本中，但是對單個惡性良性腫瘤的檢查顯示這些互相作用是患者特異的。
我們再次希望評估互相作用評分與單獨分析受體或配體的價值。除了計算互作得分與表型的相關，我們還計算了配體或受體與表型的相關。 盡管互相作用評分相關性與受體和/或配體相關性之間有着普遍的相關性，但我們再次觀察到受體和配體都沒有強烈的相關性 與表型有關，但互相作用評分密切相關(圖4C)。
為了了解觀察配體-受體對與Treg百分比相關的機率，盡管受體和配體都與Treg百分比無關，我們重新計算了相關性 使用随機配體受體對。 我們評估了在圖4C中确定的互相作用的重要性，方法是使用随機互相作用與配體-受體互相作用的一個成員是相同的，并對另一個成員進行 互相作用的ER（即使用相同的配體，但計算與随機受體的互相作用分數，反之亦然） 然後，我們比較了這些随機對與觀察到的實際互相作用的相關性。 對于圖4C中識别的兩種互動，随機互動對沒有真正的互動那麼強烈。 此外，我們還計算了配體與随機受體之間的互相作用比配體的原始相關性更強的可能性。 一般來說，配體相關性越強，随機配體受體對越不可能表現出更大的相關性。 此外，這一結果表明，配體受體對不會偶然與表型相關，即使配體表達單獨與表型密切相關。
為了研究互相作用評分如何與人類轉移性黑色素瘤背景下感興趣的表型相關，我們使用惡性良性腫瘤中T細胞數量的Tregs百分比作為表型。 考慮到我們計算了19個不同惡性良性腫瘤樣本的分數，除了使用Spearman相關性外，我們還建構了一個使用最小絕對收縮和選擇操作的預測模型 r(LASSO)回歸。 對于人類黑色素瘤資料集，我們從9，408個測量的細胞-細胞互相作用作為預測因子開始（總共可能有187，000個=100個細胞類型對3，1870個配體-受體互相作用）。然後，我們用5倍交叉驗證訓練了一個回歸模型，并确定了一組能夠預測Treg百分比的11種互相作用。 在Tregs及其配體TN FSF15上表達的惡性良性腫瘤壞死因子家族受體TNF RSF25的互相作用，以及在巨噬細胞、WER上表達的TNF RSF21受體的互相作用 Tregs百分比的預測。 此外，産生PSEN1的B細胞與NOTCH受體成熟所需的蛋白水解酶的互相作用 Tregs(Struhl和Greenwald，1999年)也預測了Tregs的百分比。
讨論
在本工作中，我們開發了一種計算方法來分析scRNA-seq資料，以篩選惡性良性腫瘤微環境中存在的所有細胞類型之間的配體-受體互相作用。 我們應用該方法，以确定六種不同的同基因小鼠惡性良性腫瘤模中常見的細胞-細胞互相作用，并确定人類轉移性黑色素瘤的患者特異的互相作用。 此外，我們證明 評價這些互相作用分數如何可以作為相關和預測模型的特征，以确定配體-受體互相作用作為生物标志物或潛在的治療靶點。
參考文獻：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7009724/