前言
在第三篇，為開發設計空間，将工藝劃分為若幹單元操作。通過因果矩陣風險管理工具，識别出四個目标區域（Focus Area），分别為步驟2-反應，步驟1-反應，步驟2-結晶，步驟1-結晶。本篇基于風險評估概要，通過多變量DoE，建立步驟1（步驟1-反應，步驟1-結晶）的設計空間。
5）-1-1 步驟1
5）-1-1-1 步驟1-反應的多變量設計
在步驟1中，CP-6上苯胺基與氯甲酸乙酯反應，得到CP-7反應混合物。反應結束後，用氫氧化鈉溶液淬滅混合物，分解掉剩餘的氯甲酸乙酯，加入正己烷，分離正己烷層，用乙醇進行溶劑蒸餾置換，從乙醇/水混合物中結晶得到中間體CP-7。
▲ 圖-2.3.S.2.6-20 步驟1工藝
對步驟1過程的兩個重點領域進行了研究：反應和結晶。
//5）-1-2-1-1 步驟2的雜質品質屬性
步驟1-反應研究的雜質品質屬性、參數和範圍
在CP-7的批次中隻觀察到一種雜質，即乙基同系物（CP-7-1），它是在步驟1中形成的，潛在影響Sakuramil的關鍵品質屬性。該雜質通過氯甲酸乙酯與氨基甲酸甲酯的氮發生反應，失去甲酸甲酯基團形成。步驟1是CP-7-1形成的來源，它是整個Sakuramil生産工藝中唯一被證明在步驟1和步驟2的結晶中幾乎沒有清除的雜質。
▲ 圖-2.3.S.2.6-10 CP-7-1 乙基同系物
此外，對其他總雜質進行監測，以确定(1)是否有新雜質産生，(2)工藝已知微量雜質水準是否增加。
通過風險評估，對潛在影響CP-7-1（其他總雜質）水準的工藝參數進行了識别。氯甲酸乙酯和堿的化學計量以及四氫呋喃的體積對CP-7品質屬性的影響最高。設計了一個實驗政策，以确定該工藝參數對這些品質屬性的控制，提高工藝的了解和穩健性，并為步驟1的制造技術建立設計空間。
此外，該研究還包括該反應可能用到的兩種堿：磷酸鈉和碳酸鈉。它們是潛在的非關鍵參數，兩種堿的影響通過可行性-交叉實驗研究确認。
規模和裝置考慮（在進行多變量DoE以建立設計空間之前）
磷酸鈉或碳酸鈉的粒度大小和攪拌速率對反應速率和産品雜質譜都沒有任何顯著的影響，這表明規模放大後，混合能力降低不是一個重要的問題。盡管氯甲酸乙酯淬滅時是兩相的，混合對攪拌很敏感，但是結果沒有副産物或安全問題，表明在規模放大時不存在與混合有關的潛在問題。
在開發過程中，沒有觀察到任何規模和/或裝置的限制，這得到了化學知識的支援。進行了額外的影響因素實驗，以了解實驗室和商業化生産時間的差異。此外，多變量實驗模拟了商業裝置及其局限性的 “最差條件”。
注：“最差條件”是指在實驗室模拟商業生産設施可能出現的最差條件下的加熱和冷卻等。例如，通過在比設定的反應溫度高10°C的溫度下進行反應，或在比設定的反應時間更長的時間内進行反應，或使用比設定的更大的投料量确認副産品或降解産物是否增加。
▲ 圖-2.3.S.2.6-11
堿的粒度大小和攪拌速度對反應速率的影響
Doe探究參數和範圍
設計并實施一個中心複合設計(CCD)：
▲ 表-2.3.S.2.6-7 步驟1-反應DoE
| 參數 | 低 | 中 | 高 | 标準操作條件 |
| 氯甲酸乙酯當量 | 2.0 | 4.75 | 7.5 | 2.5 |
| 磷酸鈉或碳酸鈉當量 | 0.75 | 2.375 | 4 | 1.1 |
| 反應濃度（L/kg，四氫呋喃體積/CP-6） | 3.0 | 9.0 | 15 | 5.8 |
* 注：為氯甲酸乙酯選擇了一個異常高的範圍，即7.5當量，試圖強調乙基同系物形成的絕對最差條件，以達到更好的工藝了解。這一水準的氯甲酸乙酯不是商業制造的選擇。
由于乙基同系物在工藝中很難清除，是以它将是限制步驟1單元操作的設計空間邊界的物料屬性。
Sakuramil中的乙基同系物的标準為1.0%。步驟1反應和結晶中的乙基同系物的多變量研究的接受标準将與1.0%相同，因為乙基同系物的衍生物在下遊的步驟1和2結晶單元中很難清除。
響應為乙基同系物的DoE等高線圖見2.3.S.2.6-12-14，其他總雜質的的DoE等高線圖見2.3.S.2.6-15-17。
CP-7-1 乙基同系物結論
- 在所有使用磷酸鹽和碳酸鹽的實驗中，測得的CP-7-1的含量明顯低于1.0%（1.0%是Sakuramil中CP-9-1的品質标準，源于乙基同系物CP-7-1）。此外，在工藝溫度為66℃（最差條件）下，36小時後在反應混合物中測得的CP-7-1的含量也遠遠低于1.0%。Sakuramil工藝步驟2不形成CP-7-1，步驟1和2的結晶單元很難清除這種雜質和下遊類似物CP-9-1。是以，為步驟1提出的設計空間在很大程度上控制了CP-7-1的形成，充分符合Sakuramil的關鍵品質屬性CP-9-1品質标準。
- 在參數多變量實驗和/或影響因素實驗中，沒有觀察到驗收标準的偏離，也沒有觀察到失敗邊緣（EoF）。
磷酸鈉和/或碳酸鈉為非關鍵參數，如下所示：
- 對于磷酸鹽，顯示形成乙基同系物的最顯著因素為堿量和濃度（四氫呋喃的體積）。低水準的堿和高水準濃度（低體積）會産生更高含量的雜質。存在于溶液中的氯甲酸乙酯的量對乙基同系物的水準沒有統計學影響。
- 對于碳酸鹽，所有三個因素都很重要，其中氯甲酸乙酯和堿之間的互動作用發揮了最大的作用。一般來說，低水準碳酸鹽，高水準濃度，高水準氯甲酸乙酯下，會産生更高含量的乙基同系物。碳酸鹽顯示極端條件下産生更多的乙基同系物。然而，在2.5當量氯甲酸乙酯的标準條件下，反應在整個設計空間中非常純淨。
- 應該注意，乙基同系物最高值（約0.3%）是在回流保溫36小時後産生的，然而反應在不到6小時就基本完成了。是以，規模和裝置時間差異不是乙基同系物生成的控制因素。
▲ 圖-2.3.S.2.6-12
磷酸鹽：乙基同系物在36小時的等高線圖
（紅點為标準操作條件：磷酸鈉當量1.1，反應濃度5.8L/kg）。
▲ 圖-2.3.S.2.6-13
碳酸鹽：乙基同系物在36小時的等高線圖
▲圖-2.3.S.2.6-14
碳酸鹽：标準條件下乙基同系物在36小時的等高線圖
(紅點為标準操作條件：磷酸鈉當量1.1，反應濃度5.8L/kg)
其他未知總雜的結論
- 在所有的實驗中，通過HPLC測定在36小時後的反應混合物面積百分比，總雜質範圍在0.3%至0.4％之間。規模放大和開發經驗表明，步驟1的結晶單元中能夠很好的将這些雜質清除至CP-7和Sakuramil品質标準以下。
- 值得注意的是，在提出的設計空間内沒有觀察到新的雜質。
▲圖-2.3.S.2.6-15
磷酸鹽：反應濃度為9L/kg，36小時其他總雜質的等高線圖
▲ 圖-2.3.S.2.6-16
碳酸鹽：36小時其他總雜質的等高線圖
▲ 圖-2.3.S.2.6-17
磷酸鹽：反應濃度為9L/kg，36小時其他總雜質的等高線圖
附加觀察：
- 一般來說，在設計空間内兩種堿的标準操作條件産生最高含量的其他總雜質。
- 磷酸鹽的實驗：根據分析，其他總雜質的含量與濃度密切相關。一般來說，其他總雜質的含量會随着高水準的堿和低水準的氯甲酸乙酯而減少。
- 碳酸鹽的實驗：一般來說，濃度較低的反應會産生更純淨的産品。
- 總的來說，碳酸鹽系列顯示比磷酸鹽更純淨。
//5）-1-1-2 步驟1-結晶的多變量設計
對于結晶DoE，實驗設計和分析政策需要分離和檢測CP-7。為了消除輸入的變異，選擇了一種具有較高含量的乙基同系物雜質粗品，以便更容易觀察和評估工藝參數對清除這種特定雜質（乙基同系物CP-7-1）的影響。參數範圍的選擇是基于經驗知識、實際生産可操作性和所需的設計空間靈活性。
規模和裝置的考慮
執行影響因素實驗，以了解實驗室和商業化生産時間的差異對品質屬性是否有任何影響。此外，多變量實驗模拟了商業裝置及其局限性的"最差條件"。
▲ 表-2.3.S.2.6-8 步驟1-結晶DoE
乙基同系物DoE等高線圖見2.3.S.2.6-18-1，去離子水體積濃度、最終濃度和最終溫度對乙基同系物含量具有統計學顯著意義（影響乙基同系物溶解度）。
▲ 圖-2.3.S.2.6-18-1 步驟1-結晶乙基同系物水準
| 參數 | 低 | 标準 | 高 |
| 冷卻速率（℃/min） | 0.15 | 0.36 | 0.5 |
| 最終溫度 | 14 | 20 | 26 |
| 最終濃度（L/kg，乙醇體積/CP-6） | 4 | 7.22 | 10 |
| 滴加時間（min） | 15 | 30 | 60 |
| 去離子水濃度（%w/w，水體積/乙醇） | 25 | 30 | 35 |
| 攪拌速率（rpm） | 150 | 250 | 350 |
| 滴加水前的保持時間（hr） | 2 | 3 | 4 |
| THF濃度（%V/V） | 1 | 3.5 | 6 |
其他總雜質DoE等高線圖見2.3.S.2.6-18-2。
▲ 圖-2.3.S.2.6-18-2 其他總雜質
結晶DoE結論
- 乙基同系物在整個結晶設計空間中較難清除。
- 在所有的實驗中，通過HPLC測定分離産物的面積百分比，總雜質範圍在0.3%至0.5％之間。規模放大和開發經驗表明，步驟1的結晶單元中能夠很好的将這些雜質清除至CP-7和Sakuramil品質标準以下。
- 值得注意的是，在提出的設計空間内沒有觀察到新的雜質。
規模與裝置
在分離前，通過延長接觸時間來改變冷卻速率的影響因素實驗沒有導緻任何雜質譜的偏離。
//5）-1-1-3 步驟1反應和結晶初始關鍵性風險評估
表-2.3.S.2.6-9對步驟1反應和結晶的多變量分析的輸出進行了總結。
▲ 表-2.3.S.2.6-9 步驟1多變量分析結果總結
| 參數 | 設計空間 | 标準條件 | 參數或屬性關鍵性論證 |
| 氯甲酸乙酯化學計量 | 2-7.5摩爾當量（CP-6） | 2.5 | 非關鍵。理由：7.5當量的水準也未使CP-7中乙基同系物增加到0.3%，而反應和原料藥中的标準為1%。 |
| 磷酸鈉或碳酸鈉化學計量 | 0.74-4摩爾當量（CP-6） | 1.1 | 非關鍵。理由：兩者都對品質沒有影響。兩者都與反應速率有關，但品質對堿的差異不敏感。 |
| 反應濃度（THF/CP-6） | 3-15L/kg（CP-6） | 5.8 | 非關鍵。理由：在參數上下範圍對乙基同系物的含量影響較低。 |
| 反應溫度 | 回流 | N/A | 非關鍵。理由：影響反應速率，非品質。 |
| 最終濃度（L/kg，乙醇體積/CP-6） | 4-10L/kg（CP-6） | 5.9 | 對其他總雜質影響程度低，其他總雜質會進一步影響API的CQA。需要在步驟2進行關鍵性評估：在整體設計空間中進行評估。 |
| 去離子水濃度（%w/w，水體積/乙醇） | 10%-50%重量比（乙醇） | 28-32% | 顯著影響其他總雜質，其他總雜質會進一步影響API的CQA。需要在步驟2進行關鍵性評估：在整體設計空間中進行評估。 |
| 最終溫度 | 14-26℃ | 20℃ | 對其他總雜質影響程度低， 其他總雜質進一步影響API的CQA。需要在步驟2進行關鍵性評估：在整體設計空間中進行評估。 |
| 幹燥溫度 | 高達50℃ | 42.5℃ | 非關鍵。理由：更高的溫度和更長時間的接觸表明沒有降解。 |
| 規模和裝置 | -- | -- | 非關鍵：理由：均相反應不依賴于規模或裝置。影響因素實驗證明長時間的接觸對品質沒有影響。 |
//5）-1-1-4 步驟1多變量總結
圖-2.3.S.2.6-19對步驟1的多變量分析結果進行了總結：
▲ 圖-2.3.S.2.6-19 步驟1的單元操作變量組合
//結論
本篇對目标區域步驟1-反應和步驟1-結晶進行了多變量DoE，建立了識别的工藝參數與CP-7品質屬性（CP-7-1，其他總雜質）的關系，完成了參數或屬性關鍵性論證風險評估。
下篇對目标區域步驟2-反應和步驟2-結晶建立設計空間，進而輸出整體設計空間和控制政策，敬請期待！
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