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CRISPR-CAS9技術的火熱和應用前景無需多提,為了了解這個領域,我們梳理了下CRISPR的發展曆程,做個學習和記錄。有疏漏和不足之處,還請指正。
1987: 大腸杆菌中報道CRISPR重複序列 (當時還不叫CRISPR)。這是長
29 bp
,間隔
32 bp
的
5
個高度同源的序列組成。當時其它原核生物中未找到同源序列,重要性未知。(日本1)
2002: CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)術語用于描述細菌和古細菌中長度在21 ~ 37 bp,中間間隔相等大小非重複序列的重複序列簇。4個CRISPR相關的基因 (cas基因)因位于CRISPR位點臨近而鑒定出來并是以命名,表明這兩者之間存在功能關系。類似我們在用STRING尋找蛋白-蛋白互作網絡中提到基于基因組位置的相關性。發現的
cas4
基因有
RecB
核酸外切功能域。 (荷蘭 2)
2005: CRISPR間隔序列發現與外源DNA比對。CRISP在更多原核基因組發現,cas家族蛋白鑒定出7個。間隔序列發現與其它基因尤其是來自于噬菌體和其它染色體外元件的序列同源。S. thermophilus (嗜熱鍊球菌)對噬菌體的敏感性與CRISPR位點出間隔序列的多少有關。作者認為間隔序列是對染色體外元件侵染的記錄,通過編碼反義RNA提供對噬菌體或外源DNA侵染的細胞免疫。(法國3)
2006: CRISPR首次提出可以作為細菌的适應性免疫系統。Koonin EV等把cas基因根據蛋白序列歸類為25個不同的家族。比較基因組學分析把CRISP-Cas系統 (CAAS)對抗入侵的噬菌體和質粒類比與真核生物中的RNA幹擾。雖然序列相差較大,但兩個系統的同工酶有很好的對應關系。但作者認為這一系統在進化上是不穩定的,因為及其相近的原核生物直接序列都相差較大。(美國4)
2007: 比2005年的研究再進一步,證明了其推論。發現病毒侵染後細菌整合來自于噬菌體基因組的序列作為新的間隔序列。移除或增加特殊的間隔序列改變了細菌的噬菌體抗性。(美國5)
2009: CRISPR RNA-cas**切割入侵RNA**首次報導。該實驗室還發現新進加入的間隔序列在細菌中轉錄豐度最高。(美國6)
2010: 與2007年的結論無異。(加拿大7)
2011: repeat/spacer來源的crRNA的前體重複序列互補的24-nt反式tracrRNA促進crRNA的成熟和發揮作用,對抗入侵者。 (瑞典8)
2012: 發現Cas9可以在crRNA與靶DNA互補配對結合的條件下作為内切酶誘導DNA雙鍊斷裂,提出RNA控制的基因組編輯。HNH功能域切割互補鍊,RuvC-樣功能域切割非互補鍊。(美國9)
2013: 短RNA介導CRISPR/Cas9用于編輯人和小鼠細胞的基因。(美國10,華人張鋒)。同年,CRISPR/Cas9應用于植物基因編輯。(美國11,英國12)
2014: Cas9與guide RNA和target DNA複合體的晶體結構。5’-NGG-3’ protospacer adjacent motif (PAM) 依賴的靶DNA的解鍊和RNA-DNA複合體的形成。(日本13,瑞士14)。
2015: 在人三原核合子(移植前胚胎)中,應用CRISPR/Cas9有效編輯内源性beta-globin基因,并且發現脫靶現象。(中國15)
2016: CRISPR/Cas9編輯的作物不被認為是轉基因作物,一是缺少外源DNA,二是不好區分。(Nature news16)
2016: NIH準許第一個CRISPR基因編輯臨床試驗,編輯T細胞治療癌症。(Nature news17)
2017: 哺乳動物中CRISPR/Cas13編輯RNA (美國18)和不需要DNA切割的高敏感低脫靶腺嘌呤堿基編輯器 (adenine base editors, ABEs) (美國19)。這兩個都是華人的工作,第二篇的作者David Liu入選2017年Nature十大人物。
2018: 人血清中發現Cas9蛋白抗體。最常用Cas9同源蛋白來自于金黃色葡萄球菌和化膿鍊球菌。這兩種菌在人群中有較高的感染頻率,79%的捐贈人和65%的捐贈人有金黃色葡萄球菌和化膿鍊球菌的抗體。 (美國20)
https://timelines.issarice.com/wiki/Timeline_of_CRISPR
這隻是比較粗淺的總結,還有很多重要的研究沒有囊入。比如CRISPR/Cas9介導的基因激活、染色體修飾的改變等。
更多關于CRISPR/CAS9的總結和發展趨勢還需要那些活躍在一線,真真正正做技術的牛人們來解答。但牛人太忙,偶爾見一面,也隻是找我們尋求服務。現在有了一個他們向大家作報告的機會。
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http://www.acadeevent.com/geneediting/index.html
References
參考文獻與上文順序一緻
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC213968/
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11952905
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16079334
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16545108
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17379808
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19945378
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21048762
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21455174
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22745249
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23287718
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23929339
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23929340