原文連結：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/tpj.16847
研究内容
在The Plant Journal上最新發表的研究中，一項突破性的發現解開了聚合草(Symphytum officinale)中吡咯裡西啶類生物堿（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）生物合成的獨特雙酶機制，這一發現不僅揭示了植物次生代謝途徑的複雜性，還為農業作物改良和降低植物毒素開辟了新途徑。
研究背景
吡咯裡西啶類生物堿（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）是一類由特定植物合成的含氮次生代謝産物，以其獨特的吡咯啉環結構而聞名，在植物化學防禦系統中扮演着至關重要的角色，有助于抵禦食草動物和病原體的侵害。然而，它們也具有顯著的毒性，能夠對人類和動物造成危害，尤其是通過食物鍊攝入時可能導緻嚴重的健康問題。是以，對吡咯裡西啶類生物堿的研究不僅有助于揭示植物的自我保護機制，還對確定食品和藥品的安全性具有重要的實際意義。
圖1 推測的吡咯裡西啶類生物堿(PAs)生物合成途徑
主要結果
1. 獨特的雙酶機制
研究人員發現了兩種高亞精胺氧化酶（HSO）同源基因SoCuAO1和SoCuAO5，它們在聚合草的不同器官中獨立參與PAs的生物合成。通過轉錄組測序技術（RNAseq），他們鑒定并确認了兩個同源基因SoCuAO1和SoCuAO5作為高亞精胺氧化酶（HSO）的候選基因。SoCuAO1和SoCuAO5與聚合草中PAs生物合成關鍵酶HSS（SoHSS）的具有一緻的共表達模式：SoCuAO1在幼葉中表達，而SoCuAO5在根中表達，而PAs主要在根部和幼葉中産生，表明它們在PAs生物合成中可能扮演關鍵角色（圖2）。此外，系統發育分析顯示SoCuAO1和SoCuAO5與已知的HiHSO聚類，為它們在PAs生物合成中的潛在功能提供了有力支援。
圖2：RT-qPCR分析，在PAs産生和非産生組織中，HSS和CuAOs基因的相對表達水準
2. SoCuAO1和SoCuAO5的體内功能驗證
通過RISPR/Cas9實驗，研究證明了這些基因在PAs合成中的關鍵性，為操縱藥用植物中的PAs含量提供了潛在的分子靶點。研究人員發現SoCuAO5基因敲除對會導緻Hspd在這些毛狀根株系中顯著積累，而PAs則完全檢測不到。這種顯著的底物積累和産物缺失，為Hspd向PAs轉化的關鍵步驟提供了直接證據，确認了SoCuAO5在PAs生物合成途徑中不可替代的作用（圖4）。此外，通過氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）對這些株系進行的代謝分析，進一步證明了SoCuAO5在催化Hspd形成PAs中的獨特功能。SoCuAO5基因敲除後的再生植物在未開花階段未檢測到PAs，但在開花階段，在花和幼葉中觀察到了PAs的合成，SoCuAO1過表達後導緻具有不同立體化學特性的PAs的産生（圖5），表明SoCuAO1在特定組織中可能具有補充功能，為了解草本聚合草中PAs生物合成的複雜機制提供了寶貴的見解。
圖4 SoCuAO5基因敲除毛狀根中Hspd和PAs水準
圖5 SoCuAO5基因敲除後植物再生過程中PAs的分析
3. SoCuAOs的體外酶活驗證
通過對SoCuAO1和SoCuAO5進行細緻的酶動力學分析，研究人員揭示了這兩種酶對特定底物Hspd具有高度的親和力和催化效率，尤其是SoCuAO5表現出比SoCuAO1更高的催化活性，此外，其催化活性還受到底物濃度的回報調控（圖6）。通過氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術，研究人員進一步鑒定了SoCuAO1和SoCuAO5作用于Hspd後産生的反應産物，确認這兩種酶能夠有效催化形成吡咯啉生物堿骨架的關鍵中間體，即單環N-(4-氨基丁基)吡咯啉離子和1-甲酰吡咯啉的兩個立體異構體（圖7）。相比之下，SoCuAO2并不參與PAs生物合成，這進一步凸顯了SoCuAO1和SoCuAO5在PAs生物合成中的獨特作用和它們與其他CuAOs在生化特性上的差異（圖7）。這些發現深化了我們對聚合草PAs生物合成途徑中關鍵酶作用的了解。
圖6 SoCuAO1、SoCuAO5和SoCuAO2與不同底物（Hspd、Spd、Put）反應的酶動力學特性
圖7 通過GC-MS分析，展示了SoCuAO1和SoCuAO5孵育後的反應産物
結論
PAs作為植物化學防禦系統的重要組成部分，有助于抵禦食草動物和病原體的侵害，同時其毒性也對人類和動物構成潛在威脅。本研究發現聚合草(Symphytum officinale)中兩種不同的高亞精胺氧化酶（HSO）同源基因SoCuAO1和SoCuAO5在不同器官中獨立參與吡咯裡西啶類生物堿 (PAs)的生物合成，不僅豐富了我們對植物自我保護機制的認識，還對確定食品和藥品的安全性具有重要的實際意義。通過深入了解PAs生物合成途徑，我們可以更好地利用植物資源，同時避免其潛在的危害。
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