- 期刊：Gut
- 影響因子：24.5
- 發表時間：2023.11
邁博士有話說
乙型肝炎病毒（HBV）可以整合到受感染肝細胞的染色體中，促進乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的産生和肝癌的發生，然而，對于慢性HBV感染患者，甚至HBsAg清除患者，HBV整合的原位分布和程度還知之甚少。本文主要探讨了轉錄活躍的HBV整合事件是否在慢性HBV感染的不同階段遍布整個肝組織，特别是在HBsAg清除的患者中。
B肝病毒(HBV)可整合到受感染肝細胞的染色體中，促進B肝表面抗原(HBsAg)的産生并導緻肝癌。在本研究中，我們旨在探索轉錄活性HBV整合事件是否在慢性HBV感染的不同階段（尤其是在HBsAg消失的患者中）遍布整個肝髒組織。
研究概述
1. 研究人群的特征
作者收集了18名慢性HBV感染患者的肝活檢組織，并進行人群特征調查。人群包括肝活檢時未治療患者（n=9）、未出現HBsAg消失的治療中(OT)患者（n=6）和HBsAg消失的患者（n=3）。
9例未治療患者中，4例為HBeAg陽性（EP）患者，記為EP1-4，5例為HBeAg陰性（EN）患者，記為EN1-5。在OT組中，6例CHB患者在肝活檢時正在接受抗病毒治療1年以上，記為OT1～6。其餘三名經過長期抗病毒治療後已實作HBsAg消失(SL)的患者被命名為SL1-3。在肝活檢時，患者SL1和SL2仍在接受NUC治療，而患者SL3已停止抗病毒治療。在納入本研究時，患者OT5和OT6在抗病毒治療前已接受過一次肝活檢，而其他患者則未接受過。
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表1患者特征調研
2. 通過空間轉錄組分析肝内細胞空間異質性
采用空間轉錄組（ST）測序分析肝内細胞異質性。每張切片包含來自兩例患者的肝活檢組織。經過資料處理，獲得了18例患者的13059個Spots，将不同切片中的這些點組合起來進行降維和聚類，共分為了7個cluster。cluster的分布在UMAP/tSNE投影空間中呈現（圖1A)群組織實體空間(圖1B），且這些cluster在空間上是互相交織在一起。
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圖1. 慢性HBV感染患者的空間異質性
作者采用了基于标記的政策對每個Spots中的細胞類型富集進行評分，并比較了各個cluster之間的分數。正常肝細胞分數在cluster 3 中較高，在cluster 4 中較低，其餘cluster中差異不大。單核細胞以及組織駐留巨噬細胞在cluster 5 中顯著富集（圖2A）。成纖維細胞、肝内皮細胞和T細胞亞型在第4 cluster中得分較高，中性粒細胞在第6 cluster中得分較高。值得注意的是，細胞cluster的組成在患者之間有所不同，EP2和OT6患者中第5 cluster的豐度明顯較高（圖2B），據此反映出不同的基質細胞和免疫細胞浸潤程度。
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圖2. 聚類比較和細胞類型評分
3. HBV整合衍生的病毒-宿主嵌合mRNA表達
為了獲得轉錄活性HBV整合的空間分布的高分辨率，作者使用ChimericSeq包在10 ×Visium ST資料中捕獲病毒-宿主嵌合reads。總體而言，在所有患者的肝活檢組織中檢測到13 154 個病毒-宿主嵌合reads，随後分析了含有轉錄活性病毒整合的Spots的空間分布。結果顯示，7.86%的肝組織Spots中存在轉錄活性HBV整合事件，所有這些Spots都以紅色突出顯示（圖3A)。每位患者中具有轉錄活性病毒整合的Spots百分比中位數為3.17%，最高百分比為HBeAg陰性且未接受治療的患者EN2 的35.50%。正在接受或曾接受抗病毒治療的患者的含有病毒整合的Spots百分比明顯低于未接受治療的患者。正在接受抗病毒治療的患者具有轉錄活性病毒整合的Spots百分比相對未接受治療的患者較低。在HBsAg丢失的患者中幾乎檢測不到具有轉錄活性病毒整合的Spots (圖3B）。
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圖3. 聚類比較和細胞類型評分
此外，這些含有病毒整合的Spots顯示出不同的嵌合讀取密度，其中來自患者EP2的Spots中總嵌合讀取的最大數量為441（圖3D）。總嵌合reads數量、獨特嵌合reads數量和獨特的病毒整合事件數量與血清HBsAg水準顯着但不強烈相關（圖4)。嵌合讀數的數量與患者年齡、已知感染持續時間、發炎等級或纖維化階段之間沒有顯著相關性。而不同病毒整合事件的數量也與血清HBV DNA水準相關。
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圖4. 轉錄活性HBV整合事件與血清HBsAg和HBV DNA水準的相關性
4. 轉錄活性HBV整合事件的差異定位
同樣，使用ChimericSeq包發現總共有5498個獨特的嵌合reads，其中90.81%（4993/5498）的病毒斷點位點被定位到HBV序列的1590和1840之間的核苷酸位置，對應于跨越直接重複序列2（DR2)和直接重複序列1（DR1）的病毒基因組區域，該區域包含增強子Ⅱ，可以上調病毒基因組的表達。（圖5A）并且發現這些轉錄活躍的HBV整合事件在細胞染色體中是随機分布的，定位于349個不同人類基因中（圖5B）。
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圖5. 人類染色體和病毒基因組上轉錄活性HBV整合位點的可視化
5. 肝内異質性表達的HBsAg和HBcAg
為了驗證轉錄活躍的病毒整合事件是否與肝切片中的HBsAg陽性一緻，利用IHC分析了HBsAg的相對分布，同時為了更準确的反映cccDNA導向的HBV表達，作者也檢測了HBcAg的IHC信号。發現EP3患者雖然表現廣泛的HBsAg和HBcAg陽性，但是隻有9.4%病毒整合的Spots，說明病毒整合事件并沒有發生在所有受感染的細胞；OT3廣泛表達HBsAg，高表達HBcAg，而隻有2.76%的病毒整合的Spots，提示HBsAg可能主要來源于肝内cccDNA；EN2含有35.5%的病毒整合Spots，HBsAg呈強陽性，而HBcAg表達陰性，提示感染的肝細胞可能存在轉錄沉默的cccDNA；SL1和SL2的HBsAg為陰性，但仍有比例較低的病毒整合Spots的存在，表明這些病毒整合對HBsAg的表達可能是沉默的。
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圖6. 空間解析代謝組學凸顯人類腎髒的解剖異質性肝内HBsAg和HBcAg呈異質性表達
6. 肝内HBV cccDNA 促進HBsAg表達
對18名有第二塊活檢組織的患者中的12 名進行了肝内總HBV DNA 和cccDNA定量分析。發現肝内cccDNA水準與含整合Spots的百分比、總嵌Reads、獨特的嵌合Reads和不同的整合事件有很好的相關性，肝内HBV總DNA水準與嵌合reads數和不同的整合事件無顯著相關，但與血清HBsAg水準相關（圖7）。
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圖6. 肝内總HBV DNA 和cccDNA水準的量化及其與轉錄活性HBV整合事件的相關性
結果讨論
綜上所述，作者空間轉錄組測序發現，所有患者（包括三名HBsAg丢失的患者）的肝組織點中有7.86%。存在13154個病毒-宿主嵌合reads。這些HBV整合位點随機分布在染色體上，可定位在與肝癌發生有關的宿主基因中，例如ALB、CLU和APOB。正在接受或曾經接受過抗病毒治療的患者與未接受過治療的患者相比，含有病毒整合的點百分比明顯較低，嵌合reads明顯較少。肝内cccDNA水準與病毒整合事件有很好的相關性。轉錄活性HBV整合發生在慢性HBV感染患者不同階段，包括HBsAg消失患者。抗病毒治療與轉錄活性病毒整合的數量和程度下降有關，這意味着早期治療幹預可能會進一步減少病毒整合事件的數量。