引言
IL-23R和IL-17是自體發炎性疾病的關鍵治療靶點，特别是在發炎性腸病（IBD）和銀屑病的治療中，抑制IL-23和IL-17的信号通路能夠顯著減輕發炎反應。然而，現有的抗體療法存在不少局限。僅約30%的IBD患者在接受抗IL-23單克隆抗體（如Stelara）治療後可達到緩解狀态，且約20%的初始響應者會由于産生抗藥抗體而逐漸失去響應。此外，系統性免疫抑制增加了患者患上惡性惡性良性腫瘤和嚴重感染的風險。由于抗體分子較大且滲透性差，無法口服，隻能通過靜脈注射或皮下注射，這對患者而言既不友善又容易産生壓力。生産和運輸抗體也相對昂貴，因為需要在哺乳動物表達系統中生産，并進行複雜的純化過程以達到适合注射的純度，同時還需冷藏儲存和運輸。6月26日Cell報道的研究“Preclinical proof of principle for orally delivered Th17 antagonist miniproteins”旨在開發可口服的IL-23R和IL-17拮抗劑小蛋白，以應對自體發炎性疾病中的治療需求。研究團隊通過計算設計，成功設計出具有抗體水準的低皮摩爾親和力和極高穩定性的IL-23R和IL-17微結合蛋白，這些小蛋白不僅能夠有效阻斷細胞信号傳導，而且在加熱、酸和蛋白水解條件下表現出極強的抵抗力。設計的IL-23R和IL-17小蛋白結合劑不僅具備低成本和易制造的優勢，還可以通過口服途徑達到治療效果。在小鼠結腸炎模型中，口服的IL-23R微結合蛋白的療效甚至優于臨床使用的抗IL-23抗體。該研究展示了口服給藥的去新設計微結合蛋白能夠穿越腸上皮屏障并達到治療靶點，具有高效力、腸道穩定性和簡便制造的優點，為口服生物制劑提供了一種新的潛在模式。總的來說，該研究證明了口服IL-23R和IL-17拮抗劑小蛋白在治療自體發炎性疾病中的巨大潛力，展示了其作為口服生物制劑的可行性和優勢，為未來相關藥物的開發和應用提供了重要參考。
自體發炎性疾病（autoinflammatory diseases）是由自身免疫系統異常引發的疾病，如發炎性腸病（IBD）和銀屑病（psoriasis）。研究發現，細胞因子IL-23和IL-17在這些疾病的發病機制中起着關鍵作用。IL-23由抗原呈遞細胞産生，促進T輔助細胞17型（Th17 cells）的分化和維持，而IL-17則由循環中的Th17細胞群組織駐留的先天淋巴細胞（ILCs）以及γδT細胞産生，具有強烈的促炎作用。是以，靶向抑制IL-23和IL-17的信号通路已成為治療自體發炎性疾病的重要政策。
盡管現有的抗體治療（如針對IL-23的單克隆抗體Stelara）在臨床上顯示出一定的療效，但這些療法存在諸多限制，如高成本、安全風險、療效不持久以及給藥不便（需注射）。是以，該研究旨在通過計算設計，開發能夠口服的IL-23R和IL-17拮抗劑微蛋白，這些微蛋白不僅具有抗體水準的高親和力，還具備極高的穩定性和低成本的制造優勢，進而為自體發炎性疾病的治療提供一種新型的、更加友善和安全的治療方式。
計算設計與篩選研究團隊首先利用計算設計方法，設計出具有低納摩爾親和力和高穩定性的IL-23R和IL-17微結合蛋白。這一過程從目标蛋白的晶體或冷凍電鏡（cryo-EM）結構開始，結合關鍵結合位點（hotspots）的資訊，通過Rosetta分子模組化套件優化蛋白的氨基酸序列和構象。最終，研究人員獲得了數千個潛在的微結合蛋白，并将編碼這些蛋白的基因轉入酵母細胞，通過多輪熒光激活細胞分選（FACS）篩選出最優的結合蛋白。
體外生化特性分析篩選出的微結合蛋白在大腸杆菌中表達并純化，研究人員通過生物層幹涉技術（BLI）和細胞信号傳導抑制實驗，定量測定這些蛋白的結合親和力和抑制效力。結果顯示，這些微結合蛋白均能以低納摩爾的親和力結合其目标蛋白，并在熱、酸和蛋白水解條件下表現出極高的穩定性。
體内實驗驗證在小鼠結腸炎模型中，研究團隊評估了口服IL-23R微結合蛋白的療效。實驗結果表明，口服的IL-23R微結合蛋白在緩解小鼠結腸發炎狀方面優于臨床使用的抗IL-23抗體。此外，通過藥代動力學和生物分布研究，發現這些微結合蛋白在大鼠體内具有良好的藥代動力學特性和分布特點，能夠穿越腸上皮屏障并到達目标組織。
通過計算設計，研究團隊成功設計出具有高親和力和高穩定性的IL-23R和IL-17微結合蛋白。其中，IL-23R微結合蛋白23R-1和23R-2分别包含55和54個氨基酸殘基，形成三個螺旋束結構，能夠有效結合IL-23R。IL-17微結合蛋白17-1、17-2和17-3則分别包含43和61個氨基酸殘基，能夠有效結合IL-17A。
體外實驗結果顯示，所設計的微結合蛋白能夠以低納摩爾的親和力結合其目标蛋白。在圓二色光譜（CD）實驗中，IL-23R微結合蛋白23R-1和23R-2的變性溫度（Tm）分别超過95°C和極高的化學變性中點濃度（5 M Gdn for 23R-1，>6 M for 23R-2）。IL-17A微結合蛋白17-1的Tm約為90°C，化學變性中點為4 M。IL-17A微結合蛋白17-2的穩定性最弱，其Tm約為70°C，化學變性中點為2 M。
IL-23R微結合蛋白在體外和體内的胃腸道穩定性（Credit: Cell）體外蛋白水解穩定性：實驗将每種微結合蛋白或作為對照的V565納米抗體（目前正在開發用于IBD的口服納米抗體）在模拟腸液（SIF）或模拟胃液（SGF）中于37°C下消化長達24小時。結果顯示，部分微結合蛋白在SGF或SIF中的穩定性較好，而有些則在較短時間内降解。殘餘結合活性：SIF和SGF消化後的樣品在不同時間點被稀釋至10 nM的微結合蛋白濃度，并通過BLI（生物層幹涉技術）測量其對人IL-23R的殘餘結合活性。結果表明，經過SGF和SIF消化後，部分微結合蛋白仍然保留對IL-23R的結合能力。大鼠體内藥代動力學研究：在健康大鼠中，單劑量口服20 mg/kg的23R-72或23R-91，采用PBS或胃腸保護性載體（GPV）配方，6小時後測量血清和目标組織中的微結合蛋白濃度。結果顯示，無論是PBS還是GPV配方，這些微結合蛋白在小腸内容物中的濃度為50-100 nM，在小腸組織中的濃度為40-200 nM，而在結腸組織中的濃度較低，為2-20 nM。在大鼠血清中未檢測到顯著濃度的微結合蛋白。血清濃度時間曲線：健康大鼠單劑量口服140 mg/kg的23R-91，在不同時間點測量血清中微結合蛋白的濃度。結果表明，微結合蛋白在15分鐘後達到血清峰值濃度73 nM，随後迅速下降，半衰期約為15分鐘，6小時後的濃度低于檢測限。
在小鼠結腸炎模型中，口服的IL-23R微結合蛋白在緩解結腸發炎狀方面表現出顯著的療效。藥代動力學研究表明，這些微結合蛋白在大鼠體内具有良好的藥代動力學特性和分布特點，能夠穿越腸上皮屏障并到達目标組織。具體資料如下：單劑量口服20 mg/kg的23R-91在健康大鼠的腸道組織和内容物中的濃度分别為50-100 nM和40-200 nM，而在結腸組織中的濃度為2-20 nM。此外，在給予單劑量140 mg/kg的23R-91後，其在大鼠血清中的濃度在15分鐘後達到峰值73 nM，随後迅速下降，半衰期約為15分鐘。
研究團隊還評估了微結合蛋白的免疫原性。23R-91具有高度的溶解性和穩定性，預計其免疫原性較低。在人體臨床試驗中，口服的23R-91未引發強烈的抗藥反應。進一步的生物資訊學分析顯示，23R-91片段與多種主要組織相容性複合體（MHC）II類分子的結合親和力較低，這與低免疫原性相關。
研究示意圖（Credit: Cell）通過計算設計開發的IL-23R和IL-17拮抗劑微蛋白展現了作為口服生物制劑的巨大潛力。相比傳統的抗體療法，這些微蛋白不僅具有高效力、低成本和易制造的優勢，還能通過口服途徑友善地給藥，極大地提高了患者的治療體驗。該研究為自體發炎性疾病的治療提供了一種全新的思路，展示了計算設計蛋白在生物醫藥領域的廣泛應用前景。未來，随着更多臨床前和臨床研究的深入開展，這些微結合蛋白有望為廣大患者帶來更加安全、有效和便捷的治療選擇。
參考文獻
Berger S, Seeger F, Yu TY, Aydin M, Yang H, Rosenblum D, Guenin-Macé L, Glassman C, Arguinchona L, Sniezek C, Blackstone A, Carter L, Ravichandran R, Ahlrichs M, Murphy M, Pultz IS, Kang A, Bera AK, Stewart L, Garcia KC, Naik S, Spangler JB, Beigel F, Siebeck M, Gropp R, Baker D. Preclinical proof of principle for orally delivered Th17 antagonist miniproteins. Cell. 2024 Jun 23:S0092-8674(24)00631-7. doi: 10.1016/j.cell.2024.05.052. Epub ahead of print. PMID: 38936360.https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.052
責編|探索君
排版|探索君
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