簡介：2009 年 Sonia Vallabh 與 Eric Minikel 新婚不久，Vallabh 的母親卻因遺傳性朊病毒病去世，Vallabh 也被查出攜帶緻病基因。為自救和拯救更多患者，毫無生物醫學背景的兩人辭去工作，從零開始學習。他們在研究中不斷取得進展，如今與團隊合作開發出表觀遺傳編輯工具 CHARM，能沉默大腦中編碼朊病毒蛋白的基因，為朊病毒病及其他神經退行性疾病提供潛在治療政策，在與時間賽跑的路上不斷前進。
2009年，正在哈佛法學院攻讀法律職業文憑的Sonia Vallabh迎來了人生的幸福時刻，她與正在麻省理工學院攻讀城市規劃與交通碩士的Eric Minikel走入了婚姻殿堂。但僅僅一年之後，一場重大變故徹底改變了這對新人的人生。
▲Eric Minikel（左）與Sonia Vallabh（右）（圖檔來源：博德研究所）
緻命的錯誤折疊
Vallabh的母親生病了。起初還隻是視力模糊，但很快各種症狀都纏上身，Vallabh母親的身體狀況急轉直下，她失去了行走能力，無法與人交流，無法進食……在出現症狀的僅僅10個月後，Vallabh的母親在恐懼中去世。但在這段時間内，始終沒有人知道真正的病因是什麼，直到屍檢報告告訴了Vallabh一個無比殘酷的結果。
她的母親死于緻死性家族性失眠症（fatal familial insomnia）——一種遺傳性朊病毒病。
在我們的大腦中，有一類被稱為朊病毒蛋白（prion protein, PrP）的細胞表面蛋白。正常情況下，PrP并不是什麼壞角色，也不會造成健康後果。然而，一旦PrP改變構象，“多米諾骨牌”開始倒下了。錯誤折疊的PrP會形成有毒的聚集體，然後在大腦内擴散傳播，導緻神經元死亡，這類緻命且無法治愈的疾病就是朊病毒病。
我們最熟悉的朊病毒病是具有傳染性的瘋牛病；除此之外，另一些朊病毒病也可以由基因突變引起，Vallabh母親患上的緻死性家族性失眠症就是PRNP D178N基因突變的結果。PRNP D178N突變屬于常染色體顯性遺傳，這意味着Vallabh有50%的機率繼承這個緻命基因。
是将這樣的擔憂藏在心裡，還是主動去了解自己的命運？一年之後，Vallabh選擇抛出這枚決定命運的硬币。基因檢測的結果是，Vallabh也攜帶了PRNP D178N突變。也就是說，Vallabh背上了一枚可能在人生任何階段“引爆”的“定時炸彈”，沒有人可以預測疾病發作的時間，但症狀一旦出現，病情進展将極為迅速，那時等待Vallabh的隻能是死亡的結局。
從零開始，逆天改命
面對這樣被“将死”的局面，對于毫無生物醫學背景的Vallabh來說，最合乎常理的做法自然是繼續自己的工作與生活，同時期待朊病毒領域的療法突破——畢竟，雖然算不上熱門領域，但全球範圍内還是有一些科學家在研究朊病毒病。如果運氣好，Vallabh還有幾十年的時間來等待。
但為了與時間賽跑，Vallabh和丈夫Minikel共同選擇了一條試圖逆天改命的道路——自己研究朊病毒病，尋找照亮自己，同時拯救更多患者的道路。
2012年，Vallabh和Minikel辭去了工作，從零開始學習生物學，并在馬薩諸塞州總醫院找到了第一份基礎的研究工作。很快他們意識到，還需要更多科學知識才能有機會成功。2014年，兩人同時申請到著名的博德研究所讀博，他們在5年後畢業，并在博德研究所組建了自己的實驗室，開始對罕見的朊病毒病的研究。
與一些科學家将基金周期作為研究時間期限不同，他們的期限是Vallabh體内随時啟動的“炸彈”倒計時。令人驚歎的是，這對半路出家的科學家在研究上很快就取得了進展。
2019年，這對夫妻與合作者在PNAS雜志上提出了利用現有工具監測腦脊液中PrP水準的新政策；一年後，他們更是在Nucleic Acids Research雜志上提出，通過反義寡核苷酸（ASO）介導，即使是不足25%的PrP抑制，也可以延長感染朊病毒小鼠的生存期并延遲疾病發作。值得一提的是，目前這款基于ASO的候選藥物ION717正處于臨床試驗階段。
與此同時，Vallabh和Minikel也沒有停下探索的腳步。與Whitehead生物醫學研究所的Jonathan Weissman教授合作，這對夫妻的又一項研究突破登上了今天的《科學》雜志！這支研究團隊合作開發了一款名為CHARM的表觀遺傳編輯工具，其可以沉默整個大腦中編碼PrP的基因，為緻命朊病毒病以及其他由有害蛋白聚集引起的神經退行性疾病患者提供了潛在的治療政策。
全新表觀遺傳編輯器
▲最新研究的CHARM表觀遺傳編輯器示意圖（圖檔來源：參考資料[1]）
這項研究的起點，要追溯到2021年時，Weissman在《細胞》雜志發表的一款基因沉默工具——CRISPRoff。要抑制PrP的生成，一個思路就是沉默目标基因。而CRISPRoff使用CRISPR基因編輯技術的構模組化塊，并利用Cas9核酸酶實作目标DNA的切割，将編輯器引導至目标基因。CRISPRoff包含一個 DNA甲基轉移酶結構域（DNMT3A），可以通過定點甲基化的表觀遺傳修飾對目标基因實作長期的沉默。
此前的研究證明了CRISPRoff可以穩定、有效地沉默編碼PrP的基因。不過，CRISPRoff的幾個缺陷還是限制了它的應用。
首先是尺寸問題。我們知道腺相關病毒 (AAV) 是向大腦遞送藥物的常用載體，和任何“貨輪”一樣，它們能裝載的“貨物”大小是有限的。不幸的是，Cas9蛋白就屬于大型貨物，無法用單個AAV載體進行遞送。是以，妥協方案隻能是加大劑量、用多個AAV載體進行裝載，但這又會導緻細胞毒性增加。另一個問題是，CRISPRoff編輯器的長期表達會帶來有害免疫反應以及脫靶效應的風險。
是以，Weissman與Vallabh、Minikel合作的目标，就是打造出不僅同樣有效，并且體積足夠小、足夠安全，能最大限度避免基因沉默時出錯的新型編輯工具。
首先要解決的就是尺寸問題。CRISPRoff使用的Cas9太大了，研究團隊的解題方案是放棄CRISPR，轉而建立了一種基于鋅指蛋白（ZFP）的表觀基因組編輯器“ZFPoff”。其中，鋅指蛋白扮演了Cas9的角色，引導編輯工具抵達目标基因。由于體積小得多，單個AAV就能實作對新型編輯器的遞送。同時，由于鋅指蛋白常見于人類細胞，是以也無需擔心自身免疫反應的風險。
解決了遞送問題後，下一個挑戰是如何進行基因沉默。由于CRISPRoff添加的DNA甲基轉移酶結構域DNMT3A會産生細胞毒性，在這裡研究人員想到了另一種政策——不再是從外部運送DNMT3A，而是直接招募細胞自身的内源性DNMT3A，進而在避免細胞毒性的同時還進一步減少了載荷。
DNMT3A本身是無活性的，接下來研究團隊還提出了在目标位點激活DNMT3A的巧妙政策。他們将DNMT3A的伴侶分子組合後連接配接到鋅指蛋白上，而鋅指蛋白會抵達目标PrP基因，是以内源性的DNMT3A就會在遇到目标基因時被激活，起到沉默基因的作用。
▲CHARM招募内源性DNMT3A，并且實作了對DNMT3A的激活（圖檔來源：參考資料[1]）
最後，這項研究還解決了此前CRISPRoff存在的脫靶問題。在他們的設計中，其中一個編輯器靶向AAV載體中的啟動子，是以新型編輯器在完成基因沉默的任務後，可以自行關閉所有編輯器的表達、實作自我沉默，進而避免了編輯工具長期表達可能導緻的不利影響。
長期抑制緻命蛋白
以上，就是Vallabh等人交上的一份名為CHARM（全稱為Coupled Histone tail for Autoinhibition Release of Methyltransferase）的漂亮答卷。在小鼠實驗中，CHARM可以敲低全腦中80%以上的PrP表達，遠超改善症狀所需的PrP抑制幅度。要知道，在Vallabh等人之前的研究中，不足25%的PrP抑制已經能夠起效。此外，CHARM編輯器在沉默目标基因後實作了自我沉默，并且沒有導緻細胞毒性以及其他不利影響。
▲CHARM的短暫表達實作了對PrP的長期抑制（圖檔來源：參考資料[1]）
對于這項可能帶來革命影響的工具，同期的觀點文章評論道：CHARM的開發引入了一種有效且安全的編輯技術，其可通過AAV遞送至大腦等難以靶向的器官，進而實作基因沉默。盡管通過甲基化實作基因沉默的持久性仍有待确認、基因沉默可能僅對部分疾病有用，但CHARM等表觀遺傳編輯器最終可能對人類健康産生類似于堿基編輯、先導編輯等工具的巨大影響。
研究團隊指出，目前他們正在對CHARM進行調整，并且實作了工具的子產品化，進一步提升其有效性、安全性以及進行大規模生産的能力。
從實驗室的基礎研究到最終療法，總是伴随着漫長而曲折的道路。對于Vallabh來說，這支“懸頂之劍”還沒有被取下，這場與時間賽跑，拯救自己以及更多患者的比賽也沒有理由止步。正如Vallabh此前在博德研究所網站上寫的那樣：我們将繼續前進，不斷更新對“前進”的了解。
參考資料：
[1] Edwin N. Neumann et al., Brain-wide silencing of prion protein by AAV-mediated delivery of an engineered compact epigenetic editor. Science (2024). DOI: 10.1126/science.ado7082
[2] A CHARMed collaboration created a potent therapy candidate for fatal prion diseases. Retrieved June 28, 2024 from https://www.eurekalert.org/news-releases/1048956
[3] Vallabh, S. M. et al. Prion protein quantification in human cerebrospinal fluid as a tool for prion disease drug development. PNAS 201901947 (2019)
[4] Minikel, E. V. et al. Prion protein lowering is a disease-modifying therapy across prion disease stages, strains and endpoints. Nucleic Acids Res. (2020)
[5] James K. Nuñez et al., Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell (2021). DOI: 10.1016/j.cell.2021.03.025