引言
緻病遺傳變異的解析一直是人類遺傳學領域的一個重要挑戰。孟德爾遺傳病相關基因的單核苷酸突變本應是人類遺傳學中最容易研究的突變類型，然而對于許多疾病基因來說，至少超過半數的單核苷酸突變的臨床重要性尚未得到确定，嚴重影響了遺傳疾病尤其是罕見遺傳病的診斷效率。深度突變篩選（Deep mutational scanning, DMS）是指通過飽和誘變産生大規模的基因變異繼而在細胞系中通過高通量方法研究遺傳變異的研究方法，該方法可以極大加快遺傳病診斷速度，深化我們對單核苷酸突變臨床重要性的認識。然而，目前深度突變篩選方法的成本和複雜性皆阻礙了相關方法在臨床研究中的廣泛應用。
2024年9月25日，耶魯大學Monkol Lek團隊和上海交通大學馬凱玥博士在Cell雜志線上發表了題為Saturation Mutagenesis-Reinforced Functional Assays (SMuRF) for Disease-related Genes的研究文章。研究人員建立了一種适用于研究疾病基因的深度突變篩選工作流程“飽和誘變助力的功能方法”——SMuRF 。該工作流程包含一種全新易操作且成本較低的飽和誘變方法、一種全新靈敏高通量的流式細胞儀新功能方法以及多種獨立驗證性功能方法，可實作對多種疾病基因的快速高效深度突變篩選。另外，為驗證和展現SMuRF的有效性，研究人員應用SMuRF對兩種α-抗肌萎縮相關糖蛋白病基因FKRP和LARGE1所有可能的單核苷酸突變進行了功能打分。結果顯示，SMuRF的建立和應用為研究各種罕見病的功能突變提供了可能性。
圖一：SMuRF生物技術開發及應用示意圖（Credit: Cell）
飽和式基因組（堿基）編輯 （SGE/SBE）是目前最廣泛使用的飽和誘變方法之一，但是其應用成本較高，且其受限于CRISPR系統的編輯效率差異，使得不同位點産生突變的覆寫程度存在難以預測的差異。是以，在臨床研究中，SGE和SBE難以在缺乏CRISPR技術經驗的疾病研究實驗室中獲得廣泛應用。
與SGE/SBE不同，PALS（programmed allelic series）是一種可以無偏好産生高覆寫飽和式突變的方法（PMID: 25559584）。研究人員基于PALS開發了同樣具有無偏好性、高覆寫性，且成本低廉、操作簡單的PALS-C方法。此外，在分子生物學生物技術開發的基礎上，研究人員專注于探究突變對細胞功能改變的影響，優化改良了一種流式細胞儀功能探測方法，高效提升了對DMS檢測的靈敏度。
圖二：SMuRF工作流程技術細節（Credit: Cell）
同時，基于上述生物技術方法的開發優化，研究人員采用SMuRF對FKRP及LARGE1的遺傳突變進行功能研究。與人類遺傳變異資料庫ClinVar及最大規模人類遺傳變異體資料庫gnomAD進行比較後，研究人員确認SMuRF打分與資料庫中報道的變異臨床分類和變異頻率相符合。接着，研究人員通過整合8個患者隊列發現SMuRF打分可以較好地反映FKRP相關疾病的嚴重程度。研究人員還比較了SMuRF和以AlphaMissense為代表的（人工智能）變異預測工具的功能打分，提出SMuRF有希望進一步提升相關人工智能工具的預測能力。随後，研究人員将SMuRF打分投射到了FKRP和LARGE1的蛋白結構上，揭示了疾病相關的重要區域。最後，秉持着“獨立的驗證明驗應是深度突變篩選工作流程中的重要一環”這一原則，研究人員使用基于LASV病毒入侵機制的高通量方法及免疫熒光染色驗證方法在肌肉細胞系中對α-DG糖基化和SMuRF打分進行了驗證。
綜上，SMuRF提供了一種操作簡便且具有成本效益的飽和誘變方法，其與高通量功能篩選技術相結合，能夠有效解決臨床上意義不明确的變異問題。SMuRF在預測疾病嚴重程度、解析關鍵結構區域，以及為計算預測模型提供訓練資料集方面展現出廣泛應用的潛力。
參考文獻
https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.08.047
責編|探索君
排版|探索君
文章來源|“BioArt”
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