前言
在第三篇，为开发设计空间，将工艺划分为若干单元操作。通过因果矩阵风险管理工具，识别出四个目标区域（Focus Area），分别为步骤2-反应，步骤1-反应，步骤2-结晶，步骤1-结晶。本篇基于风险评估概要，通过多变量DoE，建立步骤1（步骤1-反应，步骤1-结晶）的设计空间。
5）-1-1 步骤1
5）-1-1-1 步骤1-反应的多变量设计
在步骤1中，CP-6上苯胺基与氯甲酸乙酯反应，得到CP-7反应混合物。反应结束后，用氢氧化钠溶液淬灭混合物，分解掉剩余的氯甲酸乙酯，加入正己烷，分离正己烷层，用乙醇进行溶剂蒸馏置换，从乙醇/水混合物中结晶得到中间体CP-7。
▲ 图-2.3.S.2.6-20 步骤1工艺
对步骤1过程的两个重点领域进行了研究：反应和结晶。
//5）-1-2-1-1 步骤2的杂质质量属性
步骤1-反应研究的杂质质量属性、参数和范围
在CP-7的批次中只观察到一种杂质，即乙基同系物（CP-7-1），它是在步骤1中形成的，潜在影响Sakuramil的关键质量属性。该杂质通过氯甲酸乙酯与氨基甲酸甲酯的氮发生反应，失去甲酸甲酯基团形成。步骤1是CP-7-1形成的来源，它是整个Sakuramil生产工艺中唯一被证明在步骤1和步骤2的结晶中几乎没有清除的杂质。
▲ 图-2.3.S.2.6-10 CP-7-1 乙基同系物
此外，对其他总杂质进行监测，以确定(1)是否有新杂质产生，(2)工艺已知微量杂质水平是否增加。
通过风险评估，对潜在影响CP-7-1（其他总杂质）水平的工艺参数进行了识别。氯甲酸乙酯和碱的化学计量以及四氢呋喃的体积对CP-7质量属性的影响最高。设计了一个实验策略，以确定该工艺参数对这些质量属性的控制，提高工艺的理解和稳健性，并为步骤1的制造工艺建立设计空间。
此外，该研究还包括该反应可能用到的两种碱：磷酸钠和碳酸钠。它们是潜在的非关键参数，两种碱的影响通过可行性-交叉实验研究确认。
规模和设备考虑（在进行多变量DoE以建立设计空间之前）
磷酸钠或碳酸钠的粒度大小和搅拌速率对反应速率和产品杂质谱都没有任何显著的影响，这表明规模放大后，混合能力降低不是一个重要的问题。尽管氯甲酸乙酯淬灭时是两相的，混合对搅拌很敏感，但是结果没有副产物或安全问题，表明在规模放大时不存在与混合有关的潜在问题。
在开发过程中，没有观察到任何规模和/或设备的限制，这得到了化学知识的支持。进行了额外的影响因素实验，以理解实验室和商业化生产时间的差异。此外，多变量实验模拟了商业设备及其局限性的 “最差条件”。
注：“最差条件”是指在实验室模拟商业生产设施可能出现的最差条件下的加热和冷却等。例如，通过在比设定的反应温度高10°C的温度下进行反应，或在比设定的反应时间更长的时间内进行反应，或使用比设定的更大的投料量确认副产品或降解产物是否增加。
▲ 图-2.3.S.2.6-11
碱的粒度大小和搅拌速度对反应速率的影响
Doe探究参数和范围
设计并实施一个中心复合设计(CCD)：
▲ 表-2.3.S.2.6-7 步骤1-反应DoE
| 参数 | 低 | 中 | 高 | 标准操作条件 |
| 氯甲酸乙酯当量 | 2.0 | 4.75 | 7.5 | 2.5 |
| 磷酸钠或碳酸钠当量 | 0.75 | 2.375 | 4 | 1.1 |
| 反应浓度（L/kg，四氢呋喃体积/CP-6） | 3.0 | 9.0 | 15 | 5.8 |
* 注：为氯甲酸乙酯选择了一个异常高的范围，即7.5当量，试图强调乙基同系物形成的绝对最差条件，以达到更好的工艺理解。这一水平的氯甲酸乙酯不是商业制造的选择。
由于乙基同系物在工艺中很难清除，所以它将是限制步骤1单元操作的设计空间边界的物料属性。
Sakuramil中的乙基同系物的标准为1.0%。步骤1反应和结晶中的乙基同系物的多变量研究的接受标准将与1.0%相同，因为乙基同系物的衍生物在下游的步骤1和2结晶单元中很难清除。
响应为乙基同系物的DoE等高线图见2.3.S.2.6-12-14，其他总杂质的的DoE等高线图见2.3.S.2.6-15-17。
CP-7-1 乙基同系物结论
- 在所有使用磷酸盐和碳酸盐的实验中，测得的CP-7-1的含量明显低于1.0%（1.0%是Sakuramil中CP-9-1的质量标准，源于乙基同系物CP-7-1）。此外，在工艺温度为66℃（最差条件）下，36小时后在反应混合物中测得的CP-7-1的含量也远远低于1.0%。Sakuramil工艺步骤2不形成CP-7-1，步骤1和2的结晶单元很难清除这种杂质和下游类似物CP-9-1。因此，为步骤1提出的设计空间在很大程度上控制了CP-7-1的形成，充分符合Sakuramil的关键质量属性CP-9-1质量标准。
- 在参数多变量实验和/或影响因素实验中，没有观察到验收标准的偏离，也没有观察到失败边缘（EoF）。
磷酸钠和/或碳酸钠为非关键参数，如下所示：
- 对于磷酸盐，显示形成乙基同系物的最显著因素为碱量和浓度（四氢呋喃的体积）。低水平的碱和高水平浓度（低体积）会产生更高含量的杂质。存在于溶液中的氯甲酸乙酯的量对乙基同系物的水平没有统计学影响。
- 对于碳酸盐，所有三个因素都很重要，其中氯甲酸乙酯和碱之间的交互作用发挥了最大的作用。一般来说，低水平碳酸盐，高水平浓度，高水平氯甲酸乙酯下，会产生更高含量的乙基同系物。碳酸盐显示极端条件下产生更多的乙基同系物。然而，在2.5当量氯甲酸乙酯的标准条件下，反应在整个设计空间中非常纯净。
- 应该注意，乙基同系物最高值（约0.3%）是在回流保温36小时后产生的，然而反应在不到6小时就基本完成了。因此，规模和设备时间差异不是乙基同系物生成的控制因素。
▲ 图-2.3.S.2.6-12
磷酸盐：乙基同系物在36小时的等高线图
（红点为标准操作条件：磷酸钠当量1.1，反应浓度5.8L/kg）。
▲ 图-2.3.S.2.6-13
碳酸盐：乙基同系物在36小时的等高线图
▲图-2.3.S.2.6-14
碳酸盐：标准条件下乙基同系物在36小时的等高线图
(红点为标准操作条件：磷酸钠当量1.1，反应浓度5.8L/kg)
其他未知总杂的结论
- 在所有的实验中，通过HPLC测定在36小时后的反应混合物面积百分比，总杂质范围在0.3%至0.4％之间。规模放大和开发经验表明，步骤1的结晶单元中能够很好的将这些杂质清除至CP-7和Sakuramil质量标准以下。
- 值得注意的是，在提出的设计空间内没有观察到新的杂质。
▲图-2.3.S.2.6-15
磷酸盐：反应浓度为9L/kg，36小时其他总杂质的等高线图
▲ 图-2.3.S.2.6-16
碳酸盐：36小时其他总杂质的等高线图
▲ 图-2.3.S.2.6-17
磷酸盐：反应浓度为9L/kg，36小时其他总杂质的等高线图
附加观察：
- 一般来说，在设计空间内两种碱的标准操作条件产生最高含量的其他总杂质。
- 磷酸盐的实验：根据分析，其他总杂质的含量与浓度密切相关。一般来说，其他总杂质的含量会随着高水平的碱和低水平的氯甲酸乙酯而减少。
- 碳酸盐的实验：一般来说，浓度较低的反应会产生更纯净的产品。
- 总的来说，碳酸盐系列显示比磷酸盐更纯净。
//5）-1-1-2 步骤1-结晶的多变量设计
对于结晶DoE，实验设计和分析策略需要分离和检测CP-7。为了消除输入的变异，选择了一种具有较高含量的乙基同系物杂质粗品，以便更容易观察和评估工艺参数对清除这种特定杂质（乙基同系物CP-7-1）的影响。参数范围的选择是基于经验知识、实际生产可操作性和所需的设计空间灵活性。
规模和设备的考虑
执行影响因素实验，以理解实验室和商业化生产时间的差异对质量属性是否有任何影响。此外，多变量实验模拟了商业设备及其局限性的"最差条件"。
▲ 表-2.3.S.2.6-8 步骤1-结晶DoE
乙基同系物DoE等高线图见2.3.S.2.6-18-1，去离子水体积浓度、最终浓度和最终温度对乙基同系物含量具有统计学显著意义（影响乙基同系物溶解度）。
▲ 图-2.3.S.2.6-18-1 步骤1-结晶乙基同系物水平
| 参数 | 低 | 标准 | 高 |
| 冷却速率（℃/min） | 0.15 | 0.36 | 0.5 |
| 最终温度 | 14 | 20 | 26 |
| 最终浓度（L/kg，乙醇体积/CP-6） | 4 | 7.22 | 10 |
| 滴加时间（min） | 15 | 30 | 60 |
| 去离子水浓度（%w/w，水体积/乙醇） | 25 | 30 | 35 |
| 搅拌速率（rpm） | 150 | 250 | 350 |
| 滴加水前的保持时间（hr） | 2 | 3 | 4 |
| THF浓度（%V/V） | 1 | 3.5 | 6 |
其他总杂质DoE等高线图见2.3.S.2.6-18-2。
▲ 图-2.3.S.2.6-18-2 其他总杂质
结晶DoE结论
- 乙基同系物在整个结晶设计空间中较难清除。
- 在所有的实验中，通过HPLC测定分离产物的面积百分比，总杂质范围在0.3%至0.5％之间。规模放大和开发经验表明，步骤1的结晶单元中能够很好的将这些杂质清除至CP-7和Sakuramil质量标准以下。
- 值得注意的是，在提出的设计空间内没有观察到新的杂质。
规模与设备
在分离前，通过延长接触时间来改变冷却速率的影响因素实验没有导致任何杂质谱的偏离。
//5）-1-1-3 步骤1反应和结晶初始关键性风险评估
表-2.3.S.2.6-9对步骤1反应和结晶的多变量分析的输出进行了总结。
▲ 表-2.3.S.2.6-9 步骤1多变量分析结果总结
| 参数 | 设计空间 | 标准条件 | 参数或属性关键性论证 |
| 氯甲酸乙酯化学计量 | 2-7.5摩尔当量（CP-6） | 2.5 | 非关键。理由：7.5当量的水平也未使CP-7中乙基同系物增加到0.3%，而反应和原料药中的标准为1%。 |
| 磷酸钠或碳酸钠化学计量 | 0.74-4摩尔当量（CP-6） | 1.1 | 非关键。理由：两者都对质量没有影响。两者都与反应速率有关，但质量对碱的差异不敏感。 |
| 反应浓度（THF/CP-6） | 3-15L/kg（CP-6） | 5.8 | 非关键。理由：在参数上下范围对乙基同系物的含量影响较低。 |
| 反应温度 | 回流 | N/A | 非关键。理由：影响反应速率，非质量。 |
| 最终浓度（L/kg，乙醇体积/CP-6） | 4-10L/kg（CP-6） | 5.9 | 对其他总杂质影响程度低，其他总杂质会进一步影响API的CQA。需要在步骤2进行关键性评估：在整体设计空间中进行评估。 |
| 去离子水浓度（%w/w，水体积/乙醇） | 10%-50%重量比（乙醇） | 28-32% | 显著影响其他总杂质，其他总杂质会进一步影响API的CQA。需要在步骤2进行关键性评估：在整体设计空间中进行评估。 |
| 最终温度 | 14-26℃ | 20℃ | 对其他总杂质影响程度低， 其他总杂质进一步影响API的CQA。需要在步骤2进行关键性评估：在整体设计空间中进行评估。 |
| 干燥温度 | 高达50℃ | 42.5℃ | 非关键。理由：更高的温度和更长时间的接触表明没有降解。 |
| 规模和设备 | -- | -- | 非关键：理由：均相反应不依赖于规模或设备。影响因素实验证明长时间的接触对质量没有影响。 |
//5）-1-1-4 步骤1多变量总结
图-2.3.S.2.6-19对步骤1的多变量分析结果进行了总结：
▲ 图-2.3.S.2.6-19 步骤1的单元操作变量组合
//结论
本篇对目标区域步骤1-反应和步骤1-结晶进行了多变量DoE，建立了识别的工艺参数与CP-7质量属性（CP-7-1，其他总杂质）的关系，完成了参数或属性关键性论证风险评估。
下篇对目标区域步骤2-反应和步骤2-结晶建立设计空间，进而输出整体设计空间和控制策略，敬请期待！
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