- 期刊：Gut
- 影响因子：24.5
- 发表时间：2023.11
迈博士有话说
乙型肝炎病毒（HBV）可以整合到受感染肝细胞的染色体中，促进乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的产生和肝癌的发生，然而，对于慢性HBV感染患者，甚至HBsAg清除患者，HBV整合的原位分布和程度还知之甚少。本文主要探讨了转录活跃的HBV整合事件是否在慢性HBV感染的不同阶段遍布整个肝组织，特别是在HBsAg清除的患者中。
乙肝病毒(HBV)可整合到受感染肝细胞的染色体中，促进乙肝表面抗原(HBsAg)的产生并导致肝癌。在本研究中，我们旨在探索转录活性HBV整合事件是否在慢性HBV感染的不同阶段（尤其是在HBsAg消失的患者中）遍布整个肝脏组织。
研究概述
1. 研究人群的特征
作者收集了18名慢性HBV感染患者的肝活检组织，并进行人群特征调查。人群包括肝活检时未治疗患者（n=9）、未出现HBsAg消失的治疗中(OT)患者（n=6）和HBsAg消失的患者（n=3）。
9例未治疗患者中，4例为HBeAg阳性（EP）患者，记为EP1-4，5例为HBeAg阴性（EN）患者，记为EN1-5。在OT组中，6例CHB患者在肝活检时正在接受抗病毒治疗1年以上，记为OT1～6。其余三名经过长期抗病毒治疗后已实现HBsAg消失(SL)的患者被命名为SL1-3。在肝活检时，患者SL1和SL2仍在接受NUC治疗，而患者SL3已停止抗病毒治疗。在纳入本研究时，患者OT5和OT6在抗病毒治疗前已接受过一次肝活检，而其他患者则未接受过。
■ ■ ■ ■ ■
表1患者特征调研
2. 通过空间转录组分析肝内细胞空间异质性
采用空间转录组（ST）测序分析肝内细胞异质性。每张切片包含来自两例患者的肝活检组织。经过数据处理，获得了18例患者的13059个Spots，将不同切片中的这些点组合起来进行降维和聚类，共分为了7个cluster。cluster的分布在UMAP/tSNE投影空间中呈现（图1A)和组织物理空间(图1B），且这些cluster在空间上是相互交织在一起。
■ ■ ■ ■ ■
图1. 慢性HBV感染患者的空间异质性
作者采用了基于标记的策略对每个Spots中的细胞类型富集进行评分，并比较了各个cluster之间的分数。正常肝细胞分数在cluster 3 中较高，在cluster 4 中较低，其余cluster中差异不大。单核细胞以及组织驻留巨噬细胞在cluster 5 中显著富集（图2A）。成纤维细胞、肝内皮细胞和T细胞亚型在第4 cluster中得分较高，中性粒细胞在第6 cluster中得分较高。值得注意的是，细胞cluster的组成在患者之间有所不同，EP2和OT6患者中第5 cluster的丰度明显较高（图2B），据此反映出不同的基质细胞和免疫细胞浸润程度。
■ ■ ■ ■ ■
图2. 聚类比较和细胞类型评分
3. HBV整合衍生的病毒-宿主嵌合mRNA表达
为了获得转录活性HBV整合的空间分布的高分辨率，作者使用ChimericSeq包在10 ×Visium ST数据中捕获病毒-宿主嵌合reads。总体而言，在所有患者的肝活检组织中检测到13 154 个病毒-宿主嵌合reads，随后分析了含有转录活性病毒整合的Spots的空间分布。结果显示，7.86%的肝组织Spots中存在转录活性HBV整合事件，所有这些Spots都以红色突出显示（图3A)。每位患者中具有转录活性病毒整合的Spots百分比中位数为3.17%，最高百分比为HBeAg阴性且未接受治疗的患者EN2 的35.50%。正在接受或曾接受抗病毒治疗的患者的含有病毒整合的Spots百分比明显低于未接受治疗的患者。正在接受抗病毒治疗的患者具有转录活性病毒整合的Spots百分比相对未接受治疗的患者较低。在HBsAg丢失的患者中几乎检测不到具有转录活性病毒整合的Spots (图3B）。
■ ■ ■ ■ ■
图3. 聚类比较和细胞类型评分
此外，这些含有病毒整合的Spots显示出不同的嵌合读取密度，其中来自患者EP2的Spots中总嵌合读取的最大数量为441（图3D）。总嵌合reads数量、独特嵌合reads数量和独特的病毒整合事件数量与血清HBsAg水平显着但不强烈相关（图4)。嵌合读数的数量与患者年龄、已知感染持续时间、炎症等级或纤维化阶段之间没有显著相关性。而不同病毒整合事件的数量也与血清HBV DNA水平相关。
■ ■ ■ ■ ■
图4. 转录活性HBV整合事件与血清HBsAg和HBV DNA水平的相关性
4. 转录活性HBV整合事件的差异定位
同样，使用ChimericSeq包发现总共有5498个独特的嵌合reads，其中90.81%（4993/5498）的病毒断点位点被定位到HBV序列的1590和1840之间的核苷酸位置，对应于跨越直接重复序列2（DR2)和直接重复序列1（DR1）的病毒基因组区域，该区域包含增强子Ⅱ，可以上调病毒基因组的表达。（图5A）并且发现这些转录活跃的HBV整合事件在细胞染色体中是随机分布的，定位于349个不同人类基因中（图5B）。
■ ■ ■ ■ ■
图5. 人类染色体和病毒基因组上转录活性HBV整合位点的可视化
5. 肝内异质性表达的HBsAg和HBcAg
为了验证转录活跃的病毒整合事件是否与肝切片中的HBsAg阳性一致，利用IHC分析了HBsAg的相对分布，同时为了更准确的反映cccDNA导向的HBV表达，作者也检测了HBcAg的IHC信号。发现EP3患者虽然表现广泛的HBsAg和HBcAg阳性，但是只有9.4%病毒整合的Spots，说明病毒整合事件并没有发生在所有受感染的细胞；OT3广泛表达HBsAg，高表达HBcAg，而只有2.76%的病毒整合的Spots，提示HBsAg可能主要来源于肝内cccDNA；EN2含有35.5%的病毒整合Spots，HBsAg呈强阳性，而HBcAg表达阴性，提示感染的肝细胞可能存在转录沉默的cccDNA；SL1和SL2的HBsAg为阴性，但仍有比例较低的病毒整合Spots的存在，表明这些病毒整合对HBsAg的表达可能是沉默的。
■ ■ ■ ■ ■
图6. 空间解析代谢组学凸显人类肾脏的解剖异质性肝内HBsAg和HBcAg呈异质性表达
6. 肝内HBV cccDNA 促进HBsAg表达
对18名有第二块活检组织的患者中的12 名进行了肝内总HBV DNA 和cccDNA定量分析。发现肝内cccDNA水平与含整合Spots的百分比、总嵌Reads、独特的嵌合Reads和不同的整合事件有很好的相关性，肝内HBV总DNA水平与嵌合reads数和不同的整合事件无显著相关，但与血清HBsAg水平相关（图7）。
■ ■ ■ ■ ■
图6. 肝内总HBV DNA 和cccDNA水平的量化及其与转录活性HBV整合事件的相关性
结果讨论
综上所述，作者空间转录组测序发现，所有患者（包括三名HBsAg丢失的患者）的肝组织点中有7.86%。存在13154个病毒-宿主嵌合reads。这些HBV整合位点随机分布在染色体上，可定位在与肝癌发生有关的宿主基因中，例如ALB、CLU和APOB。正在接受或曾经接受过抗病毒治疗的患者与未接受过治疗的患者相比，含有病毒整合的点百分比明显较低，嵌合reads明显较少。肝内cccDNA水平与病毒整合事件有很好的相关性。转录活性HBV整合发生在慢性HBV感染患者不同阶段，包括HBsAg消失患者。抗病毒治疗与转录活性病毒整合的数量和程度下降有关，这意味着早期治疗干预可能会进一步减少病毒整合事件的数量。