至今为止，世界上所有商业化应用的转Bt基因抗虫作物中的Bt蛋白质均在细胞质内积累。但近几年的研究表明，在细胞质内积累外源抗虫蛋白质可能会产生非期望效应。如大陆获得安全证书的转基因水稻华恢1号表达的外源抗虫蛋白质Cry1Ab/c与细胞内源蛋白质Hd3a等存在相互作用（Front Bioeng Biotechnol, 2020, 8: 685; Front Plant Sci, 2021, 12: 608721; Front Bioeng Biotechnol, 2021, 9: 759016），导致转化体产生非期望效应，严重影响了该转化体的育种应用前景。最近，中国科学院亚热带农业生态研究所肖国樱研究团队的李华博士分别在Plant Cell, Tissue and Organ Culture和Pest Management Science杂志上发表文章，报道了在细胞壁积累抗虫蛋白质的新技术，彻底解决了抗虫蛋白质高表达造成非期望效应的问题，可能给转基因抗虫作物育种带来革命性的变化！
事实上，中国科学院亚热带农业生态研究所肖国樱研究团队早就注意到了抗虫蛋白质在细胞内的高表达可能存在负效应这个问题。Bt抗虫蛋白质中的Cry1C具有杀虫谱宽、半致死剂量低的优点，应用前景非常诱人（Plant Science, 2009, 176: 315-324）。他们在10多年前就开始研发转Cry1Ca基因的抗虫水稻，获得的水稻转化体B1C893-6叶片中Cry1Ca蛋白的表达量高达35.07 μg/g，表现出很好的抗虫性。但是，外源基因高表达带来的非期望效应也很明显，表现为株高变矮、穗长变短、实粒数减少、结实率降低、生育期延长等（杂交水稻, 2014, 29: 67-71)。随后研发的转基因水稻B1C106-3（Journal of Integrative Agriculture, 2018, 17(3): 493-506）叶片中Cry1Ca蛋白质的积累量为11.30 μg/g，也产生了实粒数变少、结实率降低、产量降低的非期望效应。另外1个转基因水稻E1C608-3（中国生物工程杂志, 2019, 39(11): 31-38）叶片中Cry1Ca蛋白质的含量为8.72 μ/g，同样表现出了株高变矮、穗变短、每穗总粒数减少和结实率降低等非期望效应。只有当叶片中Cry1Ca蛋白质的平均含量低至1.59 µg/g时，水稻转化体E1C4008S-4才没有检测到明显的非期望效应（Rice Science, 2020, 7(3): 215-226）。如果高表达Bt蛋白产生非期望效应的现象普遍存在，这将导致抗虫蛋白表达量高的转化体非期望效应大，非期望效应小的转化体抗虫蛋白表达量低，抗虫性和其它农艺性状不能兼顾。此外，如果生产上不使用抗虫蛋白表达量高的转化体，将会给抗虫作物高剂量/庇护所策略的实施带来严重阻碍，可能导致靶标害虫快速进化出对抗虫蛋白的抗性，这将大大缩短Bt抗虫作物的经济寿命。
为了解决Cry1Ca蛋白在细胞内高表达所带来的非期望效应问题，他们独辟蹊径，利用碳水化合物结合模块能结合纤维素等碳水化合物的特性，以及伸展蛋白信号肽引导胞外分泌的功能，创造了能分泌到胞外并锚定在细胞壁上的抗虫融合蛋白质，实现了在植物细胞壁定向积累抗虫蛋白质、赋予宿主植物对靶标害虫高抗性的同时，避免了非期望效应的发生。首先，他们利用组织切片、愈伤组织涂片、石蜡切片免疫荧光和原生质体分离等方法证明了伸展蛋白信号肽能引导抗虫蛋白质分泌到胞外，碳水化合物结合模块能把抗虫蛋白质锚定在细胞壁上（Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2023, 154: 527-539）。然后，他们利用这个策略获得了转融合抗虫蛋白基因的水稻，检测到转化体叶片中Cry1Ca蛋白含量最高达到17.5 μg/g，对鳞翅目害虫的致死率达到100%；最重要的是，得到的纯合转化体虽然叶片中Cry1Ca蛋白含量比B1C106-3和E1C608-3叶片中的都高，但是并没有出现B1C106-3和E1C608-3所出现的非期望效应（Pest Management Science, 2024, 80: 1728-1739）。之后，他们把这个策略应用到玉米上，获得的转Cry1Ca基因的玉米转化体叶片饲喂草地贪夜蛾4天，致死率就能达到100%（图1）。
图1 细胞壁积累Cry1Ca抗虫蛋白质的玉米转化体对草地贪夜蛾的抗性细胞壁定向积累抗虫蛋白质技术的建立，能够避免外源Bt蛋白质与细胞内源蛋白质可能存在的相互作用，获得抗虫性和农艺性状俱佳的转化体，突破了所有转基因作物均在细胞质内积累外源蛋白质的技术桎梏，为培育转基因抗虫作物提供了一条全新的技术路线，可能给转基因抗虫作物育种带来一场革命，从而改写转基因抗虫作物育种的历史。参考文献[1]Fu J and Liu B. Exogenous Cry1Ab/c protein recruits different endogenous proteins for its function in plant growth and development. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2020, 8: 685. https://doi.org/10.3389/fbioe.2020.00685[2]Fu J, Liu G and Liu B. Foreign Cry1Ab/c delays flowering in insect-resistant transgenic rice via interaction with Hd3a florigen. Frontiers in Plant Science, 2021, 12: 608721. https://doi.org/10.3389/fpls.2021.608721[3]Fu J, Shi Y, Liu L and Liu B. Cellular localization of exogenous Cry1Ab/c and its interaction with plasma membrane Ca2+-ATPase in transgenic rice. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2021, 9: 759016. https://doi.org/10.3389/fbioe.2021.759016[4]Li H, Deng L, Weng L, Li J, Yu J and Xiao G. The carbohydrate‑binding module mediates mCherry protein anchoring on the cell wall in rice. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2023, 154: 527-539. https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-023-02471-0[5]Li H, Deng L, Weng L, Li J, Hu W, Yu J, Xiao Y and Xiao G. Cell wall-localized Bt protein endows rice high resistance to Lepidoptera pests. Pest Management Science, 2024, 80: 1728-1739. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ps.7901
[6]Dror Avisar, Haviva Eilenberg, Menachem Keller, Noam Reznik, Michal Segal, Baruch Sneh, Aviah Zilberstein. The Bacillus thuringiensis delta-endotoxin Cry1C as a potential bioinsecticide in plants. Plant Science, 2009, 176: 315-324. http://dx.doi.org/10.1016/j.plantsci.2008.12.010[7]Deng L, Deng X, Wei S, Cao Z, Tang L and Xiao G. Development and identification of herbicide and insect resistant transgenic plant B1C893 in rice. Hybrid Rice, 2014, 29: 67-71. (in Chinese with English abstract) https://doi.org/10.16267/j.cnki.1005-3956.2014.01.022[8]Hu W, Deng X, Deng X, Deng L, Xiao Y, He X, Fu X and Xiao G. Characteristic analysis of tetra-resistant genetically modified rice. Journal of Integrative Agriculture, 2018, 17(3): 493-506. https://doi.org/10.1016/S2095-3119(17)61722-2[9]Zeng Q, Meng Q, Deng L, Li J, Yu J, Weng L and Xiao G. Identification and analysis of important phenotypes E1C608 with glyphosate resistance and lepidopteran resistance in rice. China Biotechnology, 2019, 39(11): 31-38. (in Chinese with English abstract) https://doi.org/10.13523/j.cb.20191104[10]Zeng Q, Deng L, Hu W, He X, Meng Q, Yu J, Li J, Weng L and Xiao G. Verification of glyphosate resistance, lepidopteran resistance and wide compatibility of male sterile line E1C4008S in rice. Rice Science, 2020, 27(3): 215-226. http://dx.doi.org/10.1016/j.rsci.2020.04.004
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