肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，严重危害人类的健康[1]。由于缺乏有效、准确的早期诊断方法，许多患者确诊时已处于肺癌晚期，错过了最佳治疗时机，导致了其不良预后结局[2]。传统的诊断方法主要有超声内镜引导下细针抽吸术（EUS-FNA）、磁共振成像（MRI）、低剂量螺旋CT（LDCT）及组织病理学诊断，但这些方法各自存在一些如侵入性、辐射风险等弊端[3]。因此，液体活检凭借其非侵入性和连续采样的能力而备受关注。目前，液体活检生物标志物已在肺癌的早期诊断和预后评估方面取得诸多成果。2024年4月，Journal of Experimental & Clinical Cancer Research在线发表了一篇名为“Liquid biopsy techniques and lung cancer: diagnosis, monitoring and evaluation”的综述，旨在概述肺癌液体活检中使用的分子生物标志物和检测方法，并阐述其实际应用[4]。现本文聚焦于该综述的“肺癌液体活检的生物标志物和检测方法”章节予以整理报道。
肺癌液体活检的生物标志物和检测方法
目前，循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、非编码RNA、细胞外囊泡、肿瘤代谢物、肿瘤相关抗原以及肿瘤诱导血小板作为有价值的生物标志物具有可观潜力，推动了液体活检在肿瘤研究领域的应用。
循环肿瘤细胞
循环肿瘤细胞（CTC）是源自原发或转移性肿瘤病灶的细胞，它们可能因自发或医疗操作而进入血液循环。CTC的存在大大增加了肿瘤转移和复发的风险，因为它们中的许多是转移前体细胞。这些细胞能够逃避身体的免疫清除机制，经历上皮间质转化（EMT），从而获得增强的移动性、粘附性、侵袭性和穿透力，促进血管内浸润和远处转移。
CTC的血液检测为肿瘤的评估和管理提供了重要手段。通过分析CTC的形态、遗传信息、基因型和异质性，医生可以更有效地监测患者的治疗反应，改善临床预后，并为患者提供个性化的精准治疗方案。CTC检测的临床意义在于它能够用于肿瘤的早期诊断、转移复发的预测以及肿瘤进展风险的评估，还能实时监测药物治疗的效果。
CTC的检测技术包括免疫富集和物理富集。免疫富集利用微流控芯片或免疫磁珠技术，针对CTC表面的特定抗原进行捕获；物理富集则基于CTC与血细胞的物理特性差异，如大小和密度。CTC富集的目的是减少背景血细胞的干扰，便于对CTC群体进行深入的检测和分析。检测方法涵盖蛋白质表达分析、免疫细胞化学、分子核酸检测，以及成像组织学、肿瘤突变分析和单细胞测序等，这些技术有助于全面理解肿瘤的异质性，并从不同层面描述CTC的特征。
尽管CTC在肿瘤增殖和转移过程中的确切关系还有待进一步研究，但CTC为液体活检提供了宝贵的信息，有助于全面了解肿瘤的进展情况。在肺癌患者的临床治疗中，CTC在早期诊断、预后评估和复发监测方面发挥着不可或缺的作用。
循环肿瘤DNA
循环肿瘤DNA（ctDNA）是一种在肿瘤细胞死亡后释放到血液中的DNA片段，是循环游离DNA（cfDNA）中的一部分，由肿瘤细胞的基因编码组成。ctDNA片段通常较短，长度大约在160到200碱基对之间，在cfDNA中所占比例较小，但足以提供肿瘤存在的直接证据。与肿瘤组织相比，ctDNA受肿瘤异质性的影响较小，且具有较短的半衰期，大约在15分钟到2.5小时之间，这使得它能够作为实时肿瘤标志物，为肿瘤的动态变化提供即时监测。
ctDNA检测技术的应用，已经得到了美国食品与药物监督管理局（FDA）的批准，它在肿瘤状态的早期诊断、预后评估以及复发和转移的监测方面展现出巨大潜力。ctDNA的检测侧重于发现基因突变和DNA甲基化，这些变异可能会激活致癌基因或破坏抑癌基因的功能，从而促进肿瘤的发展。由于ctDNA在血液中的含量较低，因此需要使用高灵敏度的检测技术，如扩增难治性突变系统（ARMS）、定量PCR、数字PCR和下一代测序（NGS）等。
在晚期或转移性肺癌中，ctDNA的检测尤为重要，它不仅可以预测化疗方案的效果，还可以评估患者的治疗反应和生存结果。ctDNA中的特定突变，如EGFR突变，可以作为肿瘤诊断和预后的分子标记。此外，ctDNA检测有助于识别化疗耐药性情况下的未知肿瘤组织变异，为早期诊断和预后评估提供了重要工具。
液体活检技术通过收集非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中的ctDNA，使得遗传突变的检测和新遗传变化的识别成为可能，这些变化与获得性药物抗性有关。基于ctDNA检测结果的定制治疗方案，能够显著提高临床治疗的效率。然而，ctDNA的检测也面临挑战，如ctDNA水平低、半衰期短，容易受到其他cfDNA的干扰，因此需要高度敏感的检测方法。随着DNA测序技术的进步，通过ARMS、PCR和NGS等技术，可以在DNA扩增后直接对ctDNA进行精确的定性和定量分析。尽管如此，ctDNA的临床应用还需要通过广泛的临床试验进行进一步的验证和标准化。
非编码RNA
非编码RNA（ncRNA）是一类在基因表达调控中扮演关键角色的RNA分子，它们不编码蛋白质，但能显著影响细胞内的基因和蛋白质表达。ncRNA根据长度不同，主要分为小非编码RNA（sncRNA）和长非编码RNA（lncRNA）。sncRNA通常长度小于200个核苷酸，而lncRNA则超过200个核苷酸。
在肿瘤发展过程中，ncRNA参与了多种生物过程，包括上皮-间充质转化、自噬和细胞衰老等。特别是，微RNA（miRNA）作为ncRNA的一种，通过液体活检技术检测，显示出作为肺癌早期诊断和预后监测的潜力。特定的miRNA，如miR-125、miR-21-5p、miR-200b和miR-141，与肺癌的进展及化疗敏感性存在相关性。
lncRNA，如H19、MIR22HG和LINC-PINT，在肺癌组织中表达水平的差异，可能使它们成为肺癌诊断的生物标志物和治疗的靶点。环状RNA（circRNA）通过作为miRNA的海绵来调节基因表达，其稳定性使其成为肺癌早期诊断和复发监测的合适生物标志物。
当前，ncRNA的研究方法包括转录组测序、实时荧光定量PCR、荧光原位杂交、RNA干扰和RNA结合蛋白的免疫沉淀等，这些方法为ncRNA的检测提供了多种选择，并在肺癌的临床筛查中展现出巨大的应用潜力。
非编码RNA的检测和分析对于深入理解肿瘤的复杂特性和个体差异具有重要意义。随着液体活检技术的进步，ncRNA作为生物标志物在肺癌的早期诊断、治疗反应监测、预后评估和复发监测中的应用前景十分广阔，为肺癌患者的精准医疗提供了新的可能性。
细胞外囊泡
细胞外囊泡（EVs）是细胞分泌的纳米级磷脂双层结构，对于细胞间的通讯和细胞活动的调节具有关键作用。这些囊泡能够携带信使RNA（mRNA）、miRNA、lncRNA、核酸和蛋白质等遗传物质，对细胞功能发挥至关重要的媒介功能。在肿瘤的发生和进展中，EVs通过细胞间的通讯机制，尤其是在免疫微环境的调控中发挥着活跃作用。外泌体作为EVs的一种亚型，因其稳定性和渗透能力而成为研究的热点。
EVs在液体活检中被视为一种有前途的替代工具，因为它们能提供比循环肿瘤DNA或坏死的循环肿瘤细胞更准确的肿瘤信息。EVs携带的miRNA和lncRNA等遗传信息在肿瘤进展中起着至关重要的作用，展现出作为肺癌早期诊断生物标志物的潜力。
然而，EVs在液体活检的开发中面临一些挑战，主要是生物样本中EVs的丰度较低，限制了它们的分离和表征。目前，采用的分离技术包括超速离心、超滤、分子排阻色谱、聚合物沉淀、免疫亲和色谱和微流控技术等，每种方法都有其优势和局限性。微流控技术因其便携性、快速性、低成本、易操作和低污染率而显示出特别潜力。
在EVs纯化后，对它们进行鉴定和表征对于检测携带的潜在生物标志物至关重要。外泌体通常通过EV追踪、透射电子显微镜和粒径检测来识别，而免疫印迹法、ELISA和流式细胞术用于检测EVs携带的蛋白质。新技术如电化学、比色法和纳米生物传感器的发展为EVs的鉴定和表征提供了额外的可能性，并提高了检测的灵敏度。
尽管EVs在肺癌的诊断、预后和治疗中展现出了有希望的生物学特性，但仍迫切需要优化分离技术并提高其临床转化效率，以充分利用EVs在液体活检中的潜力。
肿瘤诱导血小板
在肿瘤组织发展过程中，肿瘤细胞能够通过多种信号分子或受体影响血小板，导致肿瘤诱导血小板（TEPs）的形成。这些TEPs携带丰富的剪接RNA生物标志物和RNA特征，具有在肿瘤检测方面的应用潜力。其中，肿瘤衍生的血小板因子4已被证实在NSCLC患者中促进骨髓巨核细胞介导的血小板生成，循环中的血小板通过调节肿瘤免疫反应来促进肿瘤的进展。此外，NSCLC患者外周血中的血小板有助于识别具有临床意义的生物标志物，并提供有关肿瘤扩散和转移的信息。
检测血小板RNA的技术包括血小板RNA测序、微阵列杂交技术和逆转录聚合酶链反应，这些技术使得血小板RNA能够在肺癌的血液液体活检中发挥重要的肿瘤学诊断潜力。NGS中的RNA测序因其能够同时解析多个遗传信息而受到重视。然而，血小板RNA的复杂分离程序和从血小板RNA中分辨肿瘤标志物存在挑战，需要避免在分离TEPs和分辨肿瘤相关标志物的过程中受到ctDNA和EVs等其他生物标志物的干扰和污染。
为了提高临床前研究的效率，需要优化和简化血小板提取和RNA测序过程，以减少时间和成本消耗。这些工作将有助于TEPs作为液体活检的生物标志物，为肺癌的早期诊断、治疗反应监测和预后评估提供有价值的信息。
代谢物
肿瘤的生长和进展会诱发身体内的生理变化，尤其是全身代谢状态的改变。在增殖和转移过程中，肿瘤细胞会调整其代谢途径，并将代谢产物释放到血液中。这些代谢产物可以作为液体活检中的肿瘤标志物，有助于肺癌的早期诊断、预后评估、治疗反应监测和复发监测。
葡萄糖代谢在肿瘤细胞增殖中起着关键作用，其代谢产物，如2-羟基戊二酸、丁二酸和反丁烯二酸等是重要的信号分子，其可能通过表观遗传酶和DNA修复来调节肿瘤的进展，并与癌症患者的生存率和临床预后相关。乳酸作为主要的糖酵解代谢产物，通过组蛋白修饰促进肿瘤转移，调节基因表达和肿瘤微环境的重编程。此外，肿瘤的脂质和氨基酸代谢产物，如花生四烯酸和亚油酸等，也提供了诊断的可能性，并且色氨酸、亮氨酸和缬氨酸等氨基酸代谢产物可作为区分肿瘤和非肿瘤患者的生物标志物。
代谢组学技术，包括核磁共振（NMR）和质谱（MS），对于肿瘤代谢产物的全面检测和准确定量至关重要。NMR被越来越多地用于代谢指纹研究和体内研究。MS技术通常分为毛细管电泳-质谱、气相色谱-质谱和液相色谱-质谱。为了提高代谢物分析的效率和准确性，MS技术常与色谱分离技术联合使用。面对血液中代谢物水平低和样本制备复杂性的挑战，更新开发的离子迁移谱-质谱可避免检测重叠并扩大可检测代谢物的范围。此外，同时获取MS1和MS2谱图的策略可以提高识别代谢生物标志物的准确性。
代谢物的复杂和动态变化对代谢组学的应用构成挑战，需要改进的代谢组学方法和仪器来克服这些挑战，解决当前在代谢物检测覆盖范围、检测灵敏度、定性和定量准确性以及肿瘤空间信息缺失等方面的限制。
肿瘤相关抗原
肿瘤相关抗原（TAAs）是一类在肿瘤细胞和正常细胞上均可找到的分子标记，包括胚胎蛋白、糖蛋白抗原和鳞状细胞抗原等类型。尽管TAAs并非肿瘤细胞所特有，但它们在正常细胞中的产生量很少，在活跃分裂的肿瘤细胞中则高度表达。血液中TAAs的异常表达可能包含有关肿瘤活动、大小和基因突变等有价值信息。
研究发现，肺癌患者血清中存在针对特定TAAs的自身抗体，其可能表明肿瘤增殖，因此，TAAs有潜力作为非侵入性早期肺癌诊断的生物标志物。尤其是p53这一被广泛研究的TAA，在肿瘤中被删除或突变时，会影响免疫细胞的招募和活性，使肿瘤能够逃避免疫系统并促进癌症生长。
目前研究主要依赖于识别已知TAAs，并在患者血清中检测相应的自身抗体。主要技术包括重组cDNA表达库的血清学分析（SEREX）和蛋白质微阵列。这些技术的应用已经取得了一定的成果，如通过SEREX方法从NSCLC特异性的T7噬菌体库中分离出57种TAAs，并通过ELISA确认了它们与肺癌进展的联系。蛋白质微阵列也被用于识别与肺癌相关的特定TAAs，如GAGE7、EEF1A、PMS2P7、NOLC1和SEC15L2，其与肺癌的不同信号通路显著相关。这些研究结果强调了TAAs在肺癌早期诊断和治疗反应监测中的潜力。
参考文献：
1. 秦娜,马红霞,靳光付,等. 肺癌流行病学研究年度进展2022[J].中华医学杂志,2023,103(14):1068-1073.
2. Lu Y ,Ye D ,Zhuxin S , et al.Upregulated miRNA-182-5p expression in tumor tissue and peripheral blood samples from patients with non-small cell lung cancer is associated with downregulated Caspase 2 expression.[J].Experimental and therapeutic medicine,2020,19(1):603-610.
3. Yu C ,Emory Z ,Rui G , et al.The function of LncRNAs and their role in the prediction, diagnosis, and prognosis of lung cancer[J].Clinical and Translational Medicine,2021,11(4):e367-e367.
4. Fei R ,Qian F ,Kun Q , et al.Liquid biopsy techniques and lung cancer: diagnosis, monitoring and evaluation[J].Journal of Experimental & Clinical Cancer Research,2024,43(1):96-96.
声明：本文的发布由阿斯利康提供支持，仅供医疗卫生专业人士参考
审批编号：CN-138121
有效期至：2024-9-26