CRISPR-Cas12a是Type V-A型CRISPR-Cas核酸酶成员,目前LbCas12a、AsCas12a、FnCas12a、Mb2Cs12a等又被应用于植物基因组编辑中(Tang et al., 2017; Zhong et al., 2018; Zhang et al., 2021; Jiao et al., 2023; Hui et al., 2024),其中基于LbCas12a的植物基因组编辑工具在多基因敲除编辑、非编码RNA编辑、启动子调控区编辑等研究中显示了明显优势(Tang et al., 2017; Tang et al., 2019; Tang and Zhang, 2023; Zhou et al., 2023),为植物功能基因解析及分子育种提供了有效工具.但LbCas12a一方面需要识别“5-TTTV-3”的4碱基PAM基序,一方面室温活性相对较低(Malzahn et al., 2019),限制了其在重要农作物中的应用范围.同时,相较自然界中广泛存在的Type V-A型CRISPR-Cas12a分子资源,目前可以有效作为植物基因组编辑工具的Cas12a同系物仍然鉴定、开发有限.近日,Plant Biotechnology Journal在线发表了由西南大学/电子科技大学张勇教授及其合作团队撰写的“PAM‐relaxed and temperature‐tolerant CRISPR‐Mb3Cas12a single transcript unit systems for efficient singular and multiplexed genome editing in rice, maize, and tomato”研究论文.
该研究在对比测试了源于Helcococcus kunzii、Moraxella bovoculi、Pseudobutyrivibrio ruminis的CRISPR-HkCas12a、CRISPR-Mb3Cas12a, CRISPR-PrCas12a编辑活性及特性基础上,针对其中识别5’-TTV-3’简单PAM基序的Mb3Cas12a进行系统性工作,通过优化Mb3Cas12a核酸酶及crRNA骨架序列的关键功能元件及基序序列、核酸酶活性及稳定性相关关键氨基酸改造,构建了高效基于单转录单元(STU)的Mb3Cas12a植物基因组编辑系统.进一步应用工作中,在水稻、玉米及番茄中,实现了有效的蛋白编码基因敲除编辑、启动子调控序列编辑、microRNA功能性敲除编辑,丰富了植物基因组编辑工具箱.全文主要研究结果简述如下:
1、 CRISPR-Cas12核酸酶新成员植物基因组编辑活性及特性分析
研究人员首先基于所在团队之前开发的双Pol II启动子驱动的Cas12a植物基因组编辑骨架底盘(Tang et al., 2017),针对三个Cas12a同系物(HkCas12a、Mb3Cas12a、PrCas12a)构建了植物基因组编辑骨架载体(图1a、1b).进而,基于“原生质体瞬时转化+扩增子通量测序”策略,在水稻细胞中评估了其在5’-VTTTV-3’ PAM位点和5’-VTTV-3’ PAM位点的编辑效率.实验结果表明:HkCas12a在5’-TTTC-3’和5’-TTTG-3’位点上显示较高编辑效率(36.4%-60.8%),但在5’-VTTTA-3’位点上效率较低(8.3%);Mb3Cas12a在所有位点上显示40.0%以上的平均编辑效率,与LbCas12a相当;PrCas12a在5’-TTTG-3’位点上显示出较高编辑效率(>40.0%),但在5’-TTTA-3’和5’-TTTC-3’位点上效率较低(3.9%-7.3%)(图1c).同时,在5’-VTTV-3’ PAM位点的编辑效率,Mb3Cas12a也在所有位点上显示了高效的编辑活性(图1d).进一步水稻稳定转化实验中,针对水稻内源基因,测试了Mb3Cas12a在3个5’-TTTV-3’ PAM位点和5个5’-TTV-3’ PAM位点的稳定编辑效率.实验结果表明,Mb3Cas12a在所有目标位点均实现了有效编辑,5’-TTTV-3’ PAM位点的编辑效率为70.0%-100%,5’-TTV-3’ PAM位点的编辑效率为20.0%-70.0%(图1e-f).
图 1 3种新CRISPR-Cas12a在植物基因组编辑中PAM基序识别分析
2、 Mb3Cas12a植物基因组编辑特性分析进一步的通量编辑数据分析,发现HkCas12a、Mb3Cas12a及PrCas12a在水稻细胞中显示多样化的编辑特性:1)3个新Cas12a编辑工具诱导的突变主要是多碱基删除(图2a),且删除编辑事件为6bp-12bp的删除(图2b-2d),删除位置在PAM远端13到27nt(图2e-2g);2)使用存在碱基错配的spacer时,3种Cas12a除对PAM远端3bp的错配表现一定容错外,均体现了明确的高特异性(图2h-2k);3)HkCas12a和Mb3Cas12a在crRNA长度为19到23nt时可以产生有效编辑,而PrCas12a需要更长的spacer来实现有效编辑(图2l-2o).
图 2 3种新CRISPR-Cas12a在植物基因组编辑中的特性研究
3、 基于Mb3Cas12a的高效水稻多基因共编辑
进一步,针对3个水稻内源基因靶位点(OsDEP1-crR1、OsROC5-crR2、OsmiR528-crR3),研究人员基构建、比较了单Pol II启动子的STUHDH(Tang et al., 2016; Tang et al., 2019; Zhang et al., 2021)和双Pol II启动子的Dual Pol II多基因共编辑系统(图3a、3b).稳定遗传转化单株的Sanger测序分析结果显示,基于双核酶的STUHDH和Dual Pol II系统具有相当的多重编辑效率,在所有靶位点上产生了94.1%-100%的突变(图3b).其中STUHDH系统的双等位基因编辑效率范围为41.2%-94.1%,与Dual Pol II系统相当(61.1%-94.4%)(图3c-d),并且大多数植株在3个靶基因上产生了共编辑(图3b).
图 3 CRISPR-Mb3Cas12a在水稻中实现高效多基因共编辑
4、 Mb3Cas12a STUHDH植物基因组编辑系统多因素优化
考虑到基于双核酶的Mb3Cas12a STUHDH系统相较于Dual Pol II系统,具有结构简单、元件利用率高的优势,研究人员针对STUHDH系统进行进一步优化:1)优化了Mb3Cas12a和crRNA之间的linker序列,比较了Triplex、Comp.14以及初始STUHDH版本中的PolyA三种结构(图4a),发现PolyA在三种结构中表现突出(效率范围从23.7%-42.2%),Comp.14的编辑效率略低于PolyA(效率范围从12.1%-38.3%),而Triplex与PolyA相比编辑效率显著降低(效率范围从14.7%-27.1%)(图4b);2)优化NLS结构,比较了3C NLS(3x SV40 NLS位于Cas12aC端)、2C NLS(SV40 NLS-np NLS位于Cas12aC端)以及原始载体中使用的NC NLS(SV40 NLS与np NLS分别位于Cas12aN端和C端(图4c),发现NC NLS在三个系统中表现突出(效率范围从36.2%-69.1%),3C NLS的编辑效率略低于NC NLS(效率范围从32.5%-60.5%),而2C NLS总体上编辑效率较低(效率范围从8.5%-65.2%)(图4d);3)优化DR结构,分析了六个具有不同loop序列的DR(4n61、4n91、4n96、4n128、4n137、4n149)以及Mb3Cas12a的DR(Mb3 DR)在水稻内源位点上的编辑活性(图4e),发现4n96 DR在所有7个DR中效率最高(效率范围从17.3%-59.3%),4n61 DR和4n91 DR与Mb3 DR显示出相当的活性,编辑效率范围分别为9.6%-46.2%、10.9%-42.9%.综上结果,该研究通过使用PolyA、NC NLS和4n96 DR,开发了高效的Mb3Cas12a STUHDH植物基因组编辑系统.
图 4 CRISPR-Mb3Cas12a STUHDH植物基因组编辑系统多因素优化
Cas12a核酸酶对低温敏感,研究人员进一步对Mb3Cas12a核酸酶D172、N573和K579关键氨基酸,设计了3个Mb3Cas12a变体,Mb3Cas12a-R(D172R)、Mb3Cas12a-RRR(D172R/N573R/K579R)、Mb3Cas12a-RVRR(N573R/K579V/N583R/K635R),并基于优化的STUHDH系统进行室温编辑能力评价(图4g).结果显示:32°C时,Mb3Cas12a、Mb3Cas12a-R和Mb3Cas12a-RRR显示出相当的编辑效率(平均效率分别为42.7%、43.0%和45.4%)(图4h);在28°C时,Mb3Cas12a显示编辑效率降低,而Mb3Cas12a-R和Mb3Cas12a-RRR在保持了高编辑效率(图4h);在22°C时,所有Mb3Cas12a基因组编辑效率均有下降,但Mb3Cas12a-R和Mb3Cas12a-RRR变体在大多数靶位点上显示了超过15.0%的编辑效率,比野生型Mb3Cas12a高出两倍(图4h-4i).
5、CRISPR-Mb3Cas12a在水稻启动子编辑中的应用
研究人员使用优化的Mb3Cas12a STUHDH系统针对水稻重要农艺性状相关基因进行启动子编辑.首先,针对OsGBSS1启动子设计了12个crRNA(图5a-b),对19个T0植株的分析显示,稳定转化材料在多个靶位点上实现了有效编辑,其中编辑事件为多碱基删除.进一步分析了五个纯合T1启动子编辑植株,这些植株携带了不同大小的删除(图5c),且启动子编辑水稻植株中OsGBSS1表达水平及籽粒中直链淀粉含量有效降低(图5d-5f),其他主要农艺性状(图5g-5m)与WT植株相似.
图 5 基于Mb3Cas12a-STUHDH系统的高效水稻启动子编辑
研究人员进一步针对水稻OsD18启动子设计了12个crRNA,基于优化的Mb3Cas12a STUHDH系统构建了OsD18启动子多重编辑系统(图5n-5o),对18个T0株系的分析显示,稳定转化材料在靶位点上实现了多碱基删除有效编辑.对4个携带了不同大小删除的纯合T1水稻株系进行分析(图5p),发现这些启动子编辑株系中OsD18表达水平降低(图5q),植株呈现半矮化(平均高度从78.5cm-98.0cm,WT植物平均株高为106.0cm)(图5r、5t),除主穗的长度和主穗粒量(图5s-5u)有相对减少及分蘖数量增加外(图5v),OsD18启动子编辑株系的种子长度(图5w)、千粒重(图5x)和种子结实率(图5y)没有显著变化.
6、基于Mb3Cas12a-RRR的玉米基因组编辑系统构建
接下来,研究人员基于低温耐受的Mb3Cas12a-RRR核酸酶开发了玉米基因组编辑系统(图6a),通过玉米原生质体转化,分析了其在6个靶位点的编辑效率.其中2个位点显示了17.8%-28.6%的编辑效率,另外4个位点效率偏低(2.4%-4.6%)(图6b),这表明spacer序列和基因组位置选择对玉米基因组编辑效率影响明显.同样,Mb3Cas12a-RRR在玉米中的编辑事件主要发生在PAM远端,且为8-11bp的多碱基删除(图6c-6d).进一步,通过农杆菌介导的稳定转化方法,研究人员创制了祥249(X249)玉米自交系的ZmMIR159f稳定编辑材料(图6e),在4株转基因阳性材料中,2株为多碱基删除(11bp-16bp)的编辑事件(图6f),且有效删除了ZmMIR159成熟序列区域(图6f),实现了基于Mb3Cas12a的玉米基因组非编码RNA基因的有效敲除.
图 6 基于Mb3Cas12a-RRR STUHDH的玉米编辑系统构建及非编码RNA有效敲除编辑
7、基于Mb3Cas12a-RRR的番茄基因组编辑系统构建及多基因共编辑实现
研究人员基于Mb3Cas12a-RRR核酸酶变体,开发了双子叶植物番茄基因组编辑工具,针对8个番茄内源靶向位点,对比了多种Cas12a编辑活性(图7a).结果显示,Mb3Cas12a-RRR在番茄中显示最佳编辑活性,所有靶位点的编辑效率均大于10.0%(图7b),编辑事件同样为多碱基删除(图7c).进一步基于Mb3Cas12a-RRR STUHDH系统,针对SlMYBATV、SlGGP1和SlCYCB构建了多基因共编辑载体(图7d),通过农杆菌介导的稳定转化,随机选择25株转基因植株,进行Sanger测序和分析,发现SlMYBATV-cR、SlGGP1-cR和SlCYCB-cR位点的编辑效率分别为8.0%、12.0%和16.0%,双等位基因编辑效率分别为0%、12.0%和4.0%(图7e),三个基因的共编辑效率为4.0%,两个基因的共编辑效率为12.0%(图7f-g).481-5、481-10、481-11和481-16番茄共编辑植株果实中番茄红素含量显著增加(图7h、7i).
图 7 基于Mb3Cas12a-RRR STUHDH系统的番茄基因组编辑系统构建及多基因共编辑实现
西部(重庆)科学城种质创制大科学中心刘诗诗博士、何瑶博士为论文共同第一作者,西南大学生命科学学院/电子科技大学生命科学与技术学院张勇教授(http://smkxxy.swu.edu.cn/info/1014/2396.htm;https://scholar.google.com/citations?user=U3PtmKoAAAAJ&hl=en)、马里兰大学Yiping Qi教授、北京科技大学安学丽教授为该研究工作共同通讯作者.研究工作得到了国家科技重大专项、国家自然科学基金等项目的资助.
论文链接:
http://doi.org/10.1111/pbi.14486
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