一、從原代組織中分離細胞 将組織塊分離（散）成細胞懸液的方法有多種，最常用的是機械解離細胞法、酶學解離細胞法以及螯合劑解離細胞法。
從原代組織中獲得單細胞懸液的一般方法是酶解聚。細胞暴露在酶中的時間要盡可能的短，以保持最大的活性。下列步驟可以解聚整個組織，獲得較高産量的有活性細胞。
1、胰蛋白酶 (Trypsin)
在去除不需要的組織後，使用無菌的解剖刀和剪子把剩餘的組織切成3~4mm小片，通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉澱，去除上清液。重複清洗2到3次。
将盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25％溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100mg組織加入1ml 胰蛋白酶）。
在4℃孵育6到18小時，使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進去。
移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。
在組織碎片加入熱的完全培養基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。
通過無菌不鏽鋼絲網（100～200mm）過濾，分散所有剩餘組織。計數和接種細胞，進行培養。
2、膠原酶 (Collagenase)
用無菌解剖刀和剪子把剩餘組織切成3~4mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次。
加入膠原酶（50～200機關/ml，溶解在HBSS中）。
在37℃孵育4到18小時。加入3mM CaCl2增加解離效率。
通過無菌不鏽鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。
通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。
再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養。
3、Dispase
用無菌解剖刀和剪子把剩餘組織切成3~4mm小片，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。加入Dispase（0.6～2.4機關/ml 溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液）在37℃孵育20分鐘到幾個小時。
通過無菌不鏽鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養。
二、從原培養容器中分離細胞:以下是從基層迅速分離細胞，且保持細胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味着對于所有細胞系的廣泛應用，每一種系統最佳條件和施用濃度應該根據經驗加以确定。再次培養時檢測細胞的活性。細胞的活率應該超過90％對于無血清培養基，降低胰蛋白酶使用量。
1、移棄使用過的細胞培養基。
2、使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗細胞（看表确定正确的清洗溶液）。在培養瓶對着細胞的一面加入清洗溶液，通過轉動培養瓶1到2分鐘清洗細胞層，然後去除清洗液。
3、以2～3ml/25cm2的量，加選擇的分離液(見表)到培養瓶對着細胞的一面。確定分離液覆寫細胞層。在37℃孵育培養瓶，輕輕搖動培養瓶。通常，在5到15分鐘内，細胞就會脫落。細胞分離需要的時間因細胞系不同而有所變化。仔細監測細胞分離過程，避免細胞受損傷。對難于從培養瓶基層分離的細胞系，可以輕輕敲打，以加速分離過程。
4、當細胞完全分離時，垂直放置培養瓶，讓細胞流到培養瓶的底部。在培養瓶中加入完全培養基，通過移液管在單層細胞表面反複吹打來分散細胞。計數并再次培養細胞。
5、對于無血清培養基，加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1（v∶v）0.25mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中将抑制胰蛋白酶活性。
第三節 細胞的凍存與複蘇為了防止因污染或技術原因使長期培養功虧一篑，考慮到培養細胞因傳代而遲早會出現變異，有時因寄贈、交換和購買，培養細胞從一個實驗室轉運到另一個實驗室，最佳的政策是進行低溫儲存。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要。現簡要介紹深低溫儲存法(－70℃~－196℃)的特點。細胞深低溫儲存的基本原理是：在－70℃以下時，細胞内的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止狀态，故可以長期儲存。細胞低溫儲存的關鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度範圍内，水晶呈針狀，極易招緻細胞的嚴重損傷。
一、細胞的凍存：為避免污染造成的損失，最小化連續細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉化，需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前，細胞應該特性化并檢查是否污染。
有幾種普通培養基用來凍存細胞。對于包含有血清的培養基，成分可能如下：
包含10％甘油的完全培養基，
包含10％二甲基亞砜（DMSO）的完全培養基，
50％ 細胞條件培養基和50％含有10％甘油的新鮮培養基，或
50％ 細胞條件培養基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養基。
對于無血清培養基，一些普通的培養基成分可能是：
50％ 細胞條件無血清培養基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無血清培養基，或
包含有7.5％二甲基亞砜和10％細胞培養級BSA的新鮮無血清培養基。
1、懸浮細胞
計數将要凍存的活細胞。細胞應該處于對數生長期。以大約200～400g離心5分鐘沉澱細胞，使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細胞。
以1×107到5×107細胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養基中再次懸浮細胞，或者以0.5×107到1×1027在無血清培養基中，再次懸浮細胞。
分裝進凍存管，将凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘内開始冷凍步驟。
細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可程式設計式的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然後轉移到液氮中貯存。
2、貼壁細胞
使用分離試劑從基層分離細胞，分離時盡可能溫和，使對細胞的損傷減少到最小。
在完全生長培養基中，再次懸浮分離細胞，确定有活力細胞數。
以大約200g離心5分鐘沉澱細胞。使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細胞。
以5×106到1×106細胞/ml密度，在凍存液中懸浮細胞。
分裝進凍存管，将凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘内開始冷凍步驟。
細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可程式設計式的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然後轉移到液氮中貯存。
二、凍存細胞的複蘇:凍存細胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細胞要快速融化，并直接加入完全生長培養基中。若細胞對凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養基，然後加入完全生長培養基中。
1、直接鋪闆方法
取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。
直接用完全生長培養基鋪闆細胞。1ml凍存細胞使用10~20ml完全生長培養基。進行活細胞計數，細胞接種應該至少在3×105活細胞/ml。培養細胞12到24小時，更換新鮮的完全生長培養基，去除凍存劑。
2、離心方法
取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。
把1到2ml凍存細胞加入到大約25ml完全生長培養基，輕輕混勻。
以大約80x g離心2到3分鐘。
棄去上清。
在完全生長培養基輕輕再次懸浮細胞，并且進行活細胞計數。
細胞鋪闆，細胞接種應該至少為3×105活細胞/ml。
三、細胞的分化、衰老與死亡
1、細胞的分化:一個成年人全身細胞總數約1012個，可以區分為200多種不同類型的細胞：形态結構，代謝，行為，功能等各不相同。追根溯源，這麼多種細胞均來自一個受精卵細胞。是以，通常把發育過程中，細胞後代在形态、結構和功能上發生差異的過程稱為細胞分化。細胞分化發生在胚胎階段，也發生在胎兒出生以後，乃至成人階段。例如，人體血細胞的産生和分化，這個過程在人的一生中一直持續着。
由旺盛生長不斷分裂的細胞，轉入分化，通常從細胞周期中G1期開始時一個确定的點G0點“逃逸”出細胞周期。旺盛生長分裂的細胞和各種分化了的細胞，它們的基因表達和代謝活動各不相同。
2、細胞的衰老:體外細胞培養實驗證明：
成纖維細胞：來自胎兒傳代50次後衰老死亡,來自成人傳代20次後衰老死亡(與具體年齡有關);來自小鼠傳代14--28次後衰老死亡,來自烏龜傳代90--125次後衰老死亡。
細胞衰老過程中會發生一系列的變化，包括：蛋白質合成速度降低，已有蛋白質結構變化，特異蛋白質成份出現；同時，細胞核，線粒體，膜系統、骨架系統等都有結構、功能的改變。
細胞衰老原因，尚無定論，出現過好幾種理論與假說，其中得到較廣泛認可的是“自由基損傷假說”。
3、細胞凋亡:細胞的死亡是個體存活的正常現象，常見的細胞死亡形式有3種：壞死、凋亡和細胞毒性。多細胞生物的生命活動中，因為環境因素的突然變化或病原物的入侵，導緻一部分細胞死去，稱為細胞的病理死亡，或細胞壞死。壞死是細胞暴露于嚴重的實體或化學刺激時導緻的細胞死亡；細胞毒性是由細胞或者化學物質引起的單純的細胞殺傷事件，不依賴于其它兩種細胞死亡機理，如殺傷T細胞的細胞毒性作用。
還有一種情況，一部分細胞的死亡是生物個體正常生命活動（代謝、生長、發育、分化）的一個必要部分；似乎帶有“犧牲局部，保全整體”的意味。這種情況下的細胞死亡，明顯地受遺傳控制，稱為細胞凋亡。 凋亡（Apoptosis）則是程式性的、正常的細胞死亡，是機體清除無用的或者不想要的細胞的手段。它與細胞壞死是兩個截然不同的過程，無論從形态學、生物學還是生化的特征來說，都有明顯的差別。細胞凋亡現象普遍存在于生物界。細胞凋亡與細胞增殖、分化和衰老起着互補與平衡的作用，在多細胞動物的發育、形态建成與維持中扮演至關重要的角色。作為細胞的一種基本生命現象，凋亡失控的結果将是可怕的：凋亡不足時，易發生癌變、病毒性疾病和自身免疫疾病；而凋亡過量則可能産生獲得性免疫缺陷綜合征（HIV）、重症肝炎與退行性神經疾病，如老年性癡呆症（Alzheimer's disease）、帕金森氏症（Parkinson's disease）。是以研究細胞凋亡及其機理具有重要的理論和實踐意義。
細胞凋亡與壞死的差別
壞死 ：
形态學特征-膜完整性喪失，胞漿和線粒體膨脹，全細胞裂解。
生化特征-離子内環境失調：非能量依賴性的（被動過程，在4°C也可以發生），随機消化DNA（電泳顯示為DNA彌散狀态），Postlytic DNA斷裂。
生理學特征-影響群組細胞：由非生理學因素引起（如補體攻擊、代謝中毒、缺氧等），被巨噬細胞吞噬，周圍有明顯的發炎反應。
凋亡 ：
形态學特征-胞膜出芽，但保持完整，染色體聚集在核膜周邊，胞漿收縮、細胞核凝集，最後細胞分裂為凋亡小體，Bcl-2家族蛋白導緻線粒體膜通透性增加。
生化特征--ATP依賴性的（主動過程，在4°C不能發生），以核小體為機關剪切DNA（電泳顯示為DNA ladder），Prelytic DNA 斷裂,線粒體釋放多種因子至胞漿中（細胞色素c、AIF），Caspases級聯活化，膜對稱性改變（PS外翻）
生理學特征--隻影響單個細胞，由生理學刺激誘導（如生長因子缺乏、激素環境改變等），被臨近細胞和巨噬細胞吞噬，無發炎反應。
第四節 細胞計數及活力測定一、原理 培養的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，是以要進行細胞計數。計數結果以每毫升細胞數表示。細胞計數的原理和方法與血細胞計數相同。
在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。複蘇後的細胞也要檢查活力，了解凍存和複蘇的效果。
用台盼蘭染細胞，死細胞着色，活細胞不着色，進而可以區分死細胞與活細胞。利用細胞内某些酶與特定的試劑發生顯色反應，也可測定細胞相對數和相對活力。
二、儀器、用品與試劑
1、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計數闆、試管、吸管、酶标儀（或分光光度計）
2、試劑：0.4％台盼蘭，0.5％四甲基偶氮唑鹽（MTT）、酸化異丙醇
3、材料：細胞懸液
三、操作步驟
（一）細胞計數
1、将血球計數闆及蓋片用擦試幹淨，并将蓋片蓋在計數闆上。
2、将細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數闆之間。
3、靜置3分鐘。
4、鏡下觀察，計算計數闆四大格細胞總數，壓線細胞隻計左側和上方的。然後按下式計算：
細胞數/ml＝4大格細胞總數/ 4×10000
注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。
（二）細胞活力
1、将細胞懸液以0.5ml加入試管中。
2、加入0.5ml 0.4%台盼蘭染液，染色2一3分鐘。
3、吸取少許懸液塗于載玻片上，加上蓋片。
4、鏡下取幾個任意視野分别計死細胞和活細胞數，計細胞活力。
死細胞能被台盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。
活力測定可以和細胞計數合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。
（三）MTT法測細胞相對數和相對活力
活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解産生蘭色結晶狀甲贊顆粒積于細胞内和細胞周圍。其量與細胞數呈正比，也與細胞活力呈正比。
l、細胞懸液以1000rpm離心10分鐘，棄上清液。
2、沉澱加入0.5－1ml MTT，吹打成懸液。
3、37℃下保溫2小時。
4、加入4—5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻。
5、1000 rpm離心，取上清液酶标儀或分光光度計570nm比色，酸化異丙醇調零點。
注意：MTT法隻能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。
第五節 細胞的分裂指數一、原理：體外培養細胞生長、分裂繁殖的能力，可用分裂指數來表示。它與生長曲線有一定的聯系，如随着分裂指數的不斷提高，細胞也就進入了指數生長期。分裂指數指細胞群體中分裂細胞所占的百分比，它是測定細胞周期的一個重要名額，也是不同實驗研究選擇細胞的重要依據。
二、儀器、用品與試劑
1、儀器與用品：CO2培養箱、普通顯微鏡、細胞培養血、蓋玻片、吸管
2、試劑：培養液、胰酶、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液
三、操作步驟
1、消化細胞，将細胞懸液接至内含蓋玻片的培養皿中。
2、CO2培養箱中培養48小時，使細胞長在蓋片上。
3、取出蓋片，按下列順序操作：
PBS漂洗3分鐘→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分鐘→Giemsa液染色10分鐘→自來水沖洗。
4、蓋片晾幹後反扣在載玻片上，鏡檢。
5、計算:
分裂指數=分裂細胞數/總細胞數×100%
四、注意事項;操作時動作要輕，以免使蓋片上的細胞脫落。
第六節 細胞周期的測定一、原理:細胞周期指細胞一個世代所經曆的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。
單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現多采用其他方法測群體周期。測定細胞周期的方法很多，有同位素标記法、細胞計數法等，這裡介紹一種利用BrdU滲入測定細胞周期的方法。
BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養基後，可做為細胞DNA複制的原料，經過兩個細胞周期後，細胞中兩條單鍊均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色體上應表現為一條單體淺染。如經曆了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經曆了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。
二、儀器、用品與試劑
1、儀器、用品：同正常細胞培養
2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液
三、操作步驟
1、細胞生長至指數期時，向培養液中加入BrdU，使最終濃度為10μg/ml。
2、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。
3、48小時後正常消化細胞至離心管中，注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。
4、正常染色體制片（見第三部分：染色體技術）。
5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
6、棄去2×SSC液，流水沖洗。
7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾幹。
8、鏡檢100個分裂相，計第一、二、三、四細胞期分裂指數。
9、計算：
細胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時）