引言
随着近年來微生物組（microbiome）研究的快速發展，研究人員越來越關注腸道微生物與多種疾病之間的關系，尤其是結直腸癌（colorectal cancer，CRC）。結直腸癌是全球範圍内發病率和死亡率較高的癌症之一，其發展過程中微生物因素的作用日益被重視。然而，關于微生物組在結直腸癌發展中的确切作用仍存在不少科學問題，這些問題的解答對于開發新的預防和治療政策至關重要。4月30日Nature Medicine上發表的研究文章“Microbiome confounders and quantitative profiling challenge predicted microbial targets in colorectal cancer development”中，深入探讨了微生物組分析在預測結直腸癌中的微生物靶點時所面臨的困難和挑戰。研究指出，由于存在大量的混雜因子（confounders），目前的微生物組分析方法可能難以精确預測與結直腸癌發展密切相關的微生物靶标。該研究主要發現包括：1. 基于不同的基因組資料庫和統計方法，得到的預測結果存在顯著差異，這表明在微生物組資料分析中需要采取更為标準化和系統化的方法。2. 一些統計學上顯著的微生物标記，并不一定與結直腸癌的臨床表現直接相關，這提示需要對資料進行更深入的生物學驗證。3. 研究還強調了研究設計的透明度和開放擷取資料的重要性，確定能夠驗證和重複研究成果。該研究的意義在于，它不僅揭示了在結直腸癌研究中采用微生物組分析所面臨的科學和方法學挑戰，而且也為未來的研究提供了重要的指導，特别是在如何設計研究以及如何解釋微生物組資料方面。通過進一步優化分析方法和增強資料的透明度，未來有望在預防和治療結直腸癌方面取得更顯著的進展。
Highlights
深入探讨微生物組分析的挑戰該研究深入分析了在使用微生物組（microbiome）資料預測結直腸癌（colorectal cancer，CRC）相關微生物靶點時遇到的挑戰。研究團隊詳細讨論了混雜因子（confounders）如何影響結果的準确性，特别是如何通過改進資料處理和分析方法來提高預測的可靠性。
強調資料透明和共享文章強調了科學研究中資料透明和開放通路（open access）的重要性。研究所使用的所有資料都有詳細的可通路性描述，并且確定了研究的可重複性，這對于科學界的進步至關重要。
方法學的創新與标準化研究提出了多種改進現有微生物組分析方法的政策，包括使用标準化的資料集和統一的分析流程。這些創新不僅提升了研究的準确性，也為未來相關領域的研究提供了方法學上的參考。
增強生物統計分析的深度本研究使用了多種先進的生物統計工具（biostatistical tools）和軟體，如R包（R packages），來處理和分析複雜的微生物組資料。通過這種方式，研究能夠更準确地識别出與結直腸癌發展相關的微生物标記。
提升研究設計的嚴謹性文章詳細報告了研究設計，包括樣本收集、資料分析和結果解釋的所有細節，確定了研究的透明性和嚴謹性。這種詳盡的研究設計模式為同領域的其他研究者提供了重要的實驗設計參考。
Strategies
研究設計和資料收集本研究采用了一種綜合的研究設計，首先通過收集大量的結直腸癌（colorectal cancer，CRC）患者和健康對照組（healthy controls）的腸道微生物樣本。所有參與者都經過詳細的臨床評估和篩選，以確定資料的一緻性和可比性。樣本收集遵循了嚴格的醫學倫理準則和程式。
微生物組資料的擷取與處理研究中使用了高通量測序技術（high-throughput sequencing）來分析腸道微生物的16S rRNA基因，這是一種常用于微生物多樣性研究的方法。通過對這些資料進行嚴格的品質控制和預處理，包括去除低品質的序列和潛在的污染物，研究團隊確定了資料的準确性和可靠性。
統計和生物資訊學分析利用多種生物統計和生物資訊學工具，如R軟體包（R packages）中的phyloseq、vegan、DirichletMultinomial等，研究團隊對微生物組資料進行了深入分析。這包括微生物群落結構的多樣性分析、微生物豐度的比較以及與結直腸癌相關性的統計檢驗。此外，研究還采用了貝葉斯資訊準則（Bayesian information criterion）來選擇最佳的數學模型，用于分析微生物資料與癌症發展之間的關聯。
混雜因素的識别與控制考慮到多種潛在的混雜因素（confounders），如患者的年齡、性别、飲食習慣和生活方式等，可能影響微生物組和疾病之間的關系，研究中使用了多變量統計模型來調整這些因素的影響。通過這種方法，研究確定了發現的微生物标記與結直腸癌的關聯是獨立于這些混雜因素的。
Behind the Scenes
結直腸癌（colorectal cancer，CRC）結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是指發生在結腸或直腸的惡性惡性良性腫瘤。結腸與直腸構成了人體的大腸部分，結直腸癌是由大腸内壁的細胞失控增長形成的。這種癌症是全球範圍内常見的癌症類型之一，對男女都有較高的發病率。在全球範圍内，結直腸癌是第三常見的癌症類型，并且是導緻癌症死亡的第二大原因。據世界衛生組織（WHO）的資料顯示，每年約有190萬新的結直腸癌病例和90萬相關死亡。發病率在不同國家和地區之間存在顯著差異，通常在發達國家較高，可能與生活方式、飲食習慣和遺傳因素有關。
結直腸癌的主要臨床表現改變排便習慣：包括便秘、腹瀉或排便習慣的其他改變。血便：糞便中出現鮮紅色或黑色的血。腹痛：可能是間歇性或持續性的腹部不适或痛感。體重減輕：未經試圖減肥而出現的體重明顯下降。乏力：感覺異常疲倦或體力下降。腸梗阻的症狀：包括腹脹、腹痛、嘔吐等。
結直腸癌的治療方式取決于癌症的階段、患者的整體健康狀況以及癌症的具體位置。目前的治療手段主要包括手術、放療、化療和靶向治療等。手術治療：對于大多數局部結直腸癌，手術是首選治療方法。早期結直腸癌可能隻需局部切除，而更晚期的癌症可能需要更廣泛的手術，如全結腸切除。放療：放療常用于直腸癌的治療，特别是在手術前後，以減小惡性良性腫瘤體積或殺死剩餘的癌細胞。化療：化療常用于手術前後治療，以消除微小轉移、減少複發風險或作為晚期癌症的姑息治療。化療藥物可以口服或通過靜脈注射。靶向治療和免疫治療：針對特定的分子靶點的治療，如抗EGFR（表皮生長因子受體）或抗VEGF（血管内皮生長因子）抗體，用于某些遺傳性質的結直腸癌。免疫治療也在某些具有特定生物标志的晚期癌症中顯示出療效。
治療的難點癌症晚期發現：許多患者在診斷時癌症已處于晚期，這時候癌細胞可能已經擴散至其他器官，治療難度大幅增加。複發和轉移：即使初次治療成功，結直腸癌仍有較高的複發率和轉移潛力，尤其是晚期癌症。個體差異：患者對治療的反應存在顯著差異，治療效果因人而異，需要個體化治療方案。藥物耐藥性：随着治療的進行，癌細胞可能發展出對化療或靶向治療藥物的耐藥性。
腸道微生物與結直腸癌20世紀80-90年代：初步的研究開始揭示腸道微生物群與人體健康之間的關系。雖然這時的技術還不允許詳盡分析微生物群落的複雜性，研究者開始注意到腸道病理狀态（如發炎性腸病）與微生物失衡之間的聯系。2000年代初：随着高通量測序技術的發展，研究人員能夠更詳細地分析和比較健康與疾病狀态下的腸道微生物群落。這些技術的進步幫助研究人員開始探索腸道微生物與結直腸癌的具體關系。2006年：人類微生物組計劃（Human Microbiome Project）的啟動，标志着對人類微生物群系系統性研究的開始，為了解腸道微生物如何影響結直腸癌提供了基礎資料和方法工具。2011年：研究表明，腸道中某些特定的病原體（如Fusobacterium nucleatum）與結直腸癌的發生有關聯。這是首次明确指出特定微生物與CRC發展的直接關系。2014年及之後：研究開始揭示微生物如何通過慢性發炎、影響宿主免疫響應、以及産生緻癌物質等機制促進CRC的發展。例如，研究發現腸道細菌産生的膽汁酸代謝物可能促進腸癌的發生。近年來的發展：腸道微生物與CRC治療效果的關系也成為研究熱點，尤其是在探索微生物群落如何影響免疫治療和化療的效果方面。研究人員發現腸道微生物組成可以影響患者對某些癌症治療的反應，如免疫檢查點抑制劑的反應。該研究結果顯示，結直腸癌患者的腸道微生物組與健康對照組存在顯著差異。特别是某些細菌屬，如Fusobacterium和Peptostreptococcus，在結直腸癌患者中的豐度明顯增高，這與先前的研究結果一緻，進一步驗證了這些微生物可能在結直腸癌的發展過程中扮演重要角色。
微生物組在結直腸癌生物标記中的應用V4區域的選擇性和重要性：16S rRNA基因是細菌和古菌（archaea）鑒定的黃金标準。V4區域因其高變異性被廣泛用于微生物多樣性研究和物種識别。在結直腸癌中，通過高通量測序技術，V4區域能提供足夠的分辨率，識别出與健康和疾病狀态相關聯的細菌群體，幫助研究者了解微生物如何在腸道微環境中與宿主細胞互相作用，進而影響癌症程序。真菌和病毒的角色：盡管細菌是研究的主要焦點，但真菌和病毒的研究近年來也逐漸增加。真菌群落的失調可能影響腸道屏障功能，激活發炎反應，進而在癌症的發展中扮演角色。病毒，尤其是某些緻癌病毒（oncoviruses），已知可以直接導緻細胞癌變。在結直腸癌中，研究表明某些病毒群可能通過改變宿主的免疫反應或通過影響細胞的遺傳物質來促進惡性良性腫瘤形成。研究方法與挑戰：通過使用現代生物資訊學工具，例如Metaphlan和Kraken，研究人員能夠從複雜的微生物組資料中提取有價值的資訊。然而，這些研究面臨的挑戰包括樣本處理的标準化、資料分析的複雜性以及微生物多樣性内在的高度個體差異。
混雜因子的影響混雜因子，如患者的年齡、飲食習慣、生活方式、抗生素使用曆史等，都可能獨立地或與微生物共同影響結直腸癌的發展。例如，年輕的結直腸癌患者可能有不同的腸道微生物組成與年長患者相比。抗生素的使用曆史也能顯著改變腸道微生物群，可能掩蓋或模拟微生物與癌症之間的關聯。此外，飲食習慣，如高纖維或高脂肪飲食，也會對腸道微生物多樣性産生重要影響。在對微生物靶點的預測中，如果不适當地控制這些混雜因子，可能會導緻錯誤的結論。在本研究中，通過使用多變量統計模型來調整這些因素的影響，研究人員發現，初步認為與結直腸癌關聯顯著的某些微生物，其關聯性在調整混雜因子後顯著減弱。這一發現提示，在未來的微生物組研究中，考慮這些外部因素的影響是至關重要的。這一研究揭示了在結直腸癌微生物組研究中預測微生物靶點的複雜性，強調了在進行這類研究時需要全面考慮和控制潛在的混雜因子。未來研究應進一步探索和驗證具體微生物與結直腸癌之間的因果關系，以及這些關系如何受到患者生活方式和環境因素的共同影響。通過這種方法，科學家們可以更準确地識别真正的疾病生物标記（biomarkers），為結直腸癌的預防和治療提供更為有效的靶點。
統計方法的應用和改進為了準确識别與結直腸癌相關的微生物組成分，需要應用複雜的統計模型和生物資訊學工具，這些工具能夠處理和分析大規模的微生物組資料。在該研究中，采用了Dirichlet multinomial mixtures（DM）模型和Bayesian information criterion（BIC）等進階統計方法。DM模型是一種用于分析組成資料的統計方法，尤其适用于微生物組資料，因為它可以有效處理資料中的多重共線性和非獨立性問題。BIC則用于模型選擇，幫助研究者确定在給定資料下哪個模型更為合适，通過比較不同模型的BIC值，選擇BIC值最小的模型，以確定分析的準确性和簡潔性。在具體實施中，首先通過高通量測序技術獲得腸道微生物的16S rRNA基因序列資料，然後使用QIIME 2（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）等生物資訊學工具進行資料的初步處理，包括去噪、序列對齊和操作分類單元（Operational Taxonomic Units, OTUs）的挑選。處理後的資料輸入到DM模型中，分析不同微生物在健康個體與癌症患者之間的相對豐度差異。通過這種方法，研究發現某些特定微生物群在結直腸癌患者中的顯著變化，如增多的Fusobacterium和減少的Faecalibacterium。這些結果提供了潛在的生物标記（biomarkers）用于早期診斷和治療。此外，通過DM模型和BIC的應用，研究提高了分析的精确度，減少了假陽性的風險，使得研究結果更加可靠。
資料排除（Data exclusions）由于微生物組資料的複雜性和内在的變異性，研究人員在統計分析中排除了那些在各診斷組中少于5%的樣本中出現的、未能在物種層面（species level）分類的分類群（taxa）。這樣的排除标準是基于以下幾點考慮：統計穩定性和代表性（Statistical stability and representativeness）：出現頻率極低的物種往往不能穩定地代表微生物群落的正常狀态，也可能是偶然的環境污染或實驗誤差的結果。通過設定一個門檻值（5%），研究確定了所分析的資料在統計上具有足夠的代表性和可靠性。物種鑒定的準确性（Accuracy of species identification）：在物種層面未分類的微生物資料可能來源于目前分類資料庫中尚未明确描述的微生物，或是由于技術限制導緻的鑒定不準确。這些資料的不确定性可能對整體分析結果産生誤導性影響。生物資訊學處理的标準化（Standardization of bioinformatics processing）：在生物資訊學分析中，對原始序列資料進行過濾和預處理是常見的做法，以排除那些可能影響最終解讀的低品質或低置信度資料。此外，使用5%的門檻值可以減少計算複雜度，提高分析效率。排除這些資料後，研究焦點将集中在那些在較大比例樣本中一緻出現的、分類明确的微生物上，這有助于提高對結直腸癌相關微生物标記的發現和驗證的可靠性。例如，通過比較健康個體與CRC患者的微生物組成，研究可以更準确地識别出與疾病相關的關鍵微生物種類，進一步探讨它們在腸道健康和疾病中的潛在作用。
潛在的局限性樣本大小與統計力 (Sample Size and Statistical Power)研究中提到，沒有進行樣本大小的計算，隊列大小是基于以前的研究結果确定的。這可能限制了研究結果的統計有效性和推廣性，因為樣本大小直接影響到研究的統計功效（statistical power），進而可能導緻假陰性或假陽性結果。
資料排除标準的主觀性 (Subjectivity in Data Exclusion Criteria)研究中排除了未能在物種層面分類或在每個診斷組中少于5%樣本出現的分類群。這種排除标準雖然有助于減少噪音，但也可能排除了重要的生物學資訊，特别是那些低豐度但生物學上重要的物種。
橫斷面研究設計的限制 (Limitations of Cross-Sectional Study Design)由于這是一項橫斷面研究，無法提供因果關系的證據，隻能揭示變量之間的關聯。這種設計不足以确定微生物組變化是結直腸癌發展的原因還是結果。
微生物資料的複雜性和處理方法 (Complexity of Microbiome Data and Analytical Approaches)盡管使用了高通量測序技術和複雜的生物資訊學工具，微生物組資料的解析仍面臨挑戰，包括資料的高變異性、大量未分類的微生物以及資料處理方法的選擇可能對結果産生影響。
微生物識别的局限 (Limitations in Microbial Identification)使用16S rRNA基因測序主要限于細菌和古菌的鑒定，對于真菌和病毒等其他微生物群的分析能力有限。此外，即使是在細菌和古菌中，也存在對某些物種進行準确分類的困難。
潛在的研究方向微生物組成分的深入分析 (In-depth Analysis of Microbiome Components)未來的研究可以更深入地探讨不同微生物組成分在大腸癌發展中的具體作用及其機制。
長期追蹤與大資料分析 (Long-term Tracking and Big Data Analysis)可進行長期的患者追蹤研究，以及使用大資料分析方法，以更全面地了解微生物組變化與大腸癌發展之間的關系。
臨床應用與幹預研究 (Clinical Applications and Intervention Studies)探索基于微生物組調整的預防和幹預政策（intervention strategies），評估這些政策在實際臨床應用中預防大腸癌的潛力和有效性。
原文連結
Tito RY, Verbandt S, Aguirre Vazquez M, Lahti L, Verspecht C, Lloréns-Rico V, Vieira-Silva S, Arts J, Falony G, Dekker E, Reumers J, Tejpar S, Raes J. Microbiome confounders and quantitative profiling challenge predicted microbial targets in colorectal cancer development. Nat Med. 2024 Apr 30. doi: 10.1038/s41591-024-02963-2. Epub ahead of print. PMID: 38689063.
https://www.nature.com/articles/s41591-024-02963-2
責編|探索君
排版|探索君
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