背景
報告的基因是一種易于檢測的基因，在細胞、組織、器官或個體中表達。作為報告基因，必須滿足的條件是其表達産物在受體細胞中沒有背景表達，并且表達産物易于測量。
圖1報告了基因系統，可以使用成分或誘導啟動子驅動因素進行報告（Serganova和Blasberg，2019）。
貓基因
第一個報道的基因系統用于表征啟動子的活性 - 将啟動子元件連接配接到氯黴素乙酰轉移酶CAT基因（Shaw等人，1979），将成功建構的質粒轉染到靶細胞中，向培養基中加入14C-氯黴素，并檢測提取物中乙酰化和非乙酰化14C-氯黴素的放射性，進而計算活酶的活性以表征啟動子（An等人， 1982).
圖2在CEF細胞中，轉染了兩個質粒PSV2cat和pRSVcat，并檢測到CAT酶活性，并且在後者的實驗條件下發現了更高的CAT酶活性（An等人，1982）。
GUS 基因
在攻讀博士學位期間，傑斐遜開發了一種基于β-葡萄糖醛酸酶（β-葡萄糖醛酸酶，GUS，EC 3.2.1.31）的視覺報告系統（Jefferson等人，1986年，傑斐遜等人，1987年），該系統由大腸杆菌K-12的GUS基因編碼。
GES組織化學測試：當與5-溴-4-氯-3-膠β膠質苷（X-Gluc）孵育時，該酶将X-Gluc代謝為藍色産物。傑斐遜将這種曆史方法應用于植物，因為在高等植物中沒有可檢測的GUS活性（Jefferson等人，1987）。随後，數以萬計的實驗室在植物生物學研究中使用了gus報告系統，并一直持續到今天。
GUS光譜檢測：GUS可以與底物4-甲基傘狀酮-β-葡萄糖酸鹽（MUG）反應，産生熒光物質4-甲基傘狀酮（MU），MU激發波長為365nm，發射波長為456nm，可以用分光光度計或酶計測量（Jefferson等人，1987）。
圖3 光譜測量GUS（Jefferson等人，1987年）。131是指轉移到pBI131載體（驅動GUS基因的rbbcS啟動子）的材料，121是指轉移到pBI121載體（驅動GUS基因的CamV 35S啟動子）的材料。
LacZ基因
LacZ基因編碼大腸杆菌水解酶β半乳糖苷酶（β-半乳糖苷酶，β-gal），其β-gal将無色化合物X-gal切割成半乳糖和深藍色物質5-溴-4-靛藍（An等人，1982），其被廣泛用作細菌，酵母和哺乳動物細胞的報告系統。
藍白點篩選是使用此報告系統過濾重組物的一種方法。使用編碼β-gal歐米茄片段作為宿主的菌株，以及将β-gal α片段編碼為空載的質粒，多克隆位點（MCS）位于編碼α肽鍊的區域，是以當空載轉移到宿主細菌時，α Α片段和歐米茄片段互相補充以形成酶活性β-gal， 其中斑塊在添加到X-gal的培養基上是藍色的，并且由于靶基因的插入破壞了α片段，是以酶β-gal無法形成，是以重組物呈現白色。
圖4 藍白點屏蔽示意圖。圖檔來源：DAWINBIO。
GFP基因
綠色熒光蛋白（GFP）首先從水母中分離出來（Shimomura等人，1962年），其中含有238種氨基酸，在激發光中發出綠色熒光。最令人驚訝的是，它的熒光染發簇是自發的（由Ser65-Tyr66-Gly67三肽自催化形成對羟基苯亞甲唑而産生），不需要額外的底物，酶和輔因子，這意味着蛋白質可以直接在任何生物體中表達和發光，是以GFP迅速成為細胞生物學和分子生物學中研究和使用最廣泛的蛋白質之一。科學家Roger Y. Tsien，Osamu Shimomura和Martin Chalfie也因發現和修改GFP蛋白而獲得2008年諾貝爾化學獎。
圖5 GFP最初來自維多利亞水母（Aequorea victoria）。圖檔來源：維基百科。
圖6 各種熒光蛋白。圖檔來源：維基百科。
表1 幾種常見的熒光蛋白及其相對于野生GFP的突變位置。
轉移到GFP的生物圖7是美麗的隐藏線蟲，果蠅，兔子，強奸，小鼠，斑馬魚，HeLa細胞，果蠅胚胎細胞，變形蟲胚胎細胞和小鼠浦肯野細胞（Chalfie，2009）。
熒光素酶
螢火蟲深深植根于中國文化，既是美國"氟雪囊"的傳播，也是"銀燭秋光冷屏，光羅小扇熒光"的傑作傳播。
黑暗中的蘑菇。圖檔來源：Origami-Tumblr。
熒光素酶（Luc）是所有産生生物熒光的氧化酶的通用術語，與熒光蛋白發光機制不同，熒光素酶不需要外部光源，但需要添加稱為熒光素的底物。
圖8 生物熒光和熒光蛋白發光的差別。生物熒光是指熒光素-ATP-氧中的熒光素酶、Mg2加催化作用産生幾種物質和光，熒光蛋白發光被激發光源激發後電子被激發到高能級，然後躍升到低能級的過程中發出比激發光波長更長的熒光。
最着名的發光生物是螢火蟲，其次是真菌，如蘑菇，細菌和一些藻類。目前研究得很好的熒光素酶是一種來自螢火蟲的熒光素酶和一種來自Renilla reniformis的熒光素酶。熒光素酶應用最廣泛的實驗是雙熒光素酶報告基因檢測實驗，小原稍後将詳細介紹。
圖9 分别來自螢火蟲、細菌和鞭打藻類的熒光素酶。
紅寶石基因
要檢測或染色GUS需要添加底物4-MUG或X-Gluc，觀察GFP等熒光蛋白需要熒光激發，檢測熒光素酶需要添加底物熒光素，多次樣品會被檢測或觀察損壞，是否有非侵入性、連續和可視化的報告系統？
在甜菜和火龍果中看到的鮮紅色是甜菜紅積累的結果，而甜菜的生物合成已經得到很好的研究，隻需三種酶促反應即可将酪氨酸轉化為甜菜紅素。在二進制載體T-DNA上插入一個包含這三種酶（RUBY）的閱讀框，而不是真核抗性篩選基因，并使用紅色來表征轉基因陽性愈合或植物（He等人，2020）。
圖10将三個甜菜根生物合成基因組合到一個開放的閱讀盒中，僅使用一個啟動子和終止子，并在每個基因之間插入2A肽，翻譯後，2A肽自我剪切，釋放三種酶（He等人，2020）。
圖11使用RUBY系統的轉基因植物和愈合（He等人，2020年）。（a） CaMV 35S起動機驅動RUBY系統，右邊是轉基因變形蟲;（b）泛素啟動子驅動RUBY系統，右邊是轉基因變形蟲;（c） 種子特異性啟動子 At2S3 驅動 RU BY 系統，葉和莖無 RUBY 表達，種子中 RUBY 表達;（d） YUC4：紅寶石植物在雌性葉子的尖端和頂部顯示紅色;和（e）DR5：RUBY在水稻愈合組織中表達;(f）與e-DR：eGFP;（g-h）DR5：RUBY與DR5：eGFP水稻根葉比較。
二
關于報告基因的一些反常識發現
由于一些報道的基因（如GFP）被廣泛用于分子和細胞生物學，許多團隊開始研究基因對受體細胞的影響。最早的研究表明，三種常見的野生GFP突變會促進細胞凋亡（Liu等人，1999）。在内皮細胞中，GFP本身選擇性地誘導内皮細胞中某些基因的表達，例如通過以劑量依賴性方式檢測GFP以誘導HSP70在轉錄和蛋白質水準上的表達（Zhang等人，2003）。在大鼠心肌細胞中，發現GFP的過表達會影響心肌細胞的收縮（Nishimura等人，2006）。增強的GFP（eGFP）在肌肉細胞中的表達損害了其收縮特性，因為eGFP與肌紅蛋白頭結合，進而幹擾肌因子 - 肌紅蛋白互相作用，這反過來又幹擾肌肉細胞的收縮功能（Agbulut等人，2007）。在神經元中，由神經元特異性啟動子thy1驅動的黃色熒光蛋白（YFP）的表達改變了神經元的細胞特征（Comley等人，2011）。利用全基因組DNA微陣列技術，研究了GFP對心肌細胞的影響，結果表明212個基因的表達發生了變化，其中174個被修飾，38個被修飾（Badrian bogoyevitch，2007）。分析GFP在穩定表達後對乳腺癌細胞蛋白質組學的影響發現，GFP可能對細胞量表的結構，細胞應激反應等産生影響（Coumans等人，2014）。
在植物領域，似乎對報告的基因進行的毒性研究很少。小媛在工作中被不少老師問及是否直接利用亞細胞定位載體做基因修飾表達實驗，小媛會建議，在鑒定基因功能之前不要使用帶有熒光蛋白或其他報道基因的載體進行基因修飾表達實驗，以免報告基因的正常功能影響靶蛋白;例如，協同IP實驗可用于蛋白質互測。
圖12使用Co-IP技術檢測RRS1和RPS4，RRS1B和RPS4B之間的互相作用（Saucet等人，2015）。這裡小原還插了一個我們在做客戶實驗時經常發現的現象：在Co-IP實驗中，發現使用GFP抗體會ip到多種蛋白質（如圖2、3、5、6通道右側），這是融合蛋白斷裂後連接配接GFP的靶基因。
小原需要提醒大家，在基因功能研究中，轉移到gFP和其他報告基因的受體細胞/組織必須謹慎對待作為對照測試結果，并且在基因功能不确定之前，應将具有報告基因的載體用作轉基因載體。盡管在某些情況下，人們對報告的基因毒性存在一些擔憂，但它仍然是最可靠和最易于使用的生物學研究方法之一。
三
報告基因在實驗中的應用
亞細胞定位 - 以熒光蛋白為報告基因
亞細胞定位實驗建構将靶基因的N面或C側與熒光蛋白融合的載體，使用瞬時轉化技術使用雷射共聚焦顯微鏡（共聚焦顯微鏡）觀察細胞内蛋白質的特定位置，例如在細胞核，細胞質，細胞膜或細胞器中。亞細胞定位實驗包括常見定位實驗、共定位實驗和 BiFC 實驗。
圖13在原生質中觀察到蛋白質的亞細胞定位（Liu等人，2020）。
圖14 我們的亞細胞定位空pBWA（V）HS-gfp，載體有兩個BsaI酶切割點，可以無縫連接配接靶基因。
視訊加載...
博曉源
閃亮的 GFP-GFP 報告基因
視訊編号
組織表達分析 - 美元作為報告基因
靶基因的啟動子與GUS報告基因連接配接，基因表達的強度和啟動子的表達強度可以根據組織染色的結果來确定。
圖15 GUS作為不同組織中基因表達模式基因分析的報告（Qin等人，2011）。
圖16 我們的啟動子分析了空的pBWA（V）H-gus，GUS基因5'端左酶切割位點，可以連接配接到靶基因啟動子。
酵母雙 - ADE2 ， HIS3 ， AUR1 - C ， MEL1 作為報告基因
酵母雙重雜交是廣泛用于大多數生物體破譯基因功能和信号通路的強大工具。該方法出現于20世紀90年代，酵母雙雜交是基于真核生物轉移因子具有兩個可分離的結構域，DNA結合域（結合domin，BD）和活性結構域（激活結構域，AD）的觀察。DNA結合結構域負責轉錄因子在特定DNA序列上的結合，激活結構域的功能是激活基因的轉錄。BD和AD不一定必須存在于同一蛋白質中才能發揮作用，這兩個結構域在實體上是分開的，當兩個結構域非常接近時，發生靶基因的轉錄激活。是以，蛋白質之間互相作用的存在是通過測試報告的基因激活表達來表征的。
圖17 我們的酵母單雜交誘餌載體。
圖18 我們的酵母雙雜交獵物載體。
圖19 我們的酵母雙雜交項目傳遞圖。
酵母單蕊草 - AUR1-C作為報告基因
酵母單混的原理類似于雙異質性，它将GAL4的DNA結合域替換成蛋白編碼基因庫，是以隻要它表達的蛋白質與靶序列互相作用，它也可以通過轉錄激活域激活RNA聚合酶，并啟動下遊報告基因的轉錄。
圖20 酵母單核化原理。
圖21 我們的酵母單雜交誘餌載體。酵母單胎的獵物載體是雙雜交的獵物載體。
圖22酵母單細胞實驗證明AaTCP14可以與DBR2和ALDH1啟動子上的TCP結合位點（Ma等人，2018）結合。
雙氟化酶報告遺傳檢測系統 - 使用熒光素酶作為報告基因
雙熒光素酶報告基因檢測系統（雙熒光素酶報告基因檢測）：在單熒光素酶檢測系統（僅限螢火蟲熒光素酶）的基礎上，引入海洋腎熒光素酶基因，消除不同組間細胞生長、細胞計數和轉染效率的幹擾，使實驗結果更加可靠。
圖23 雙氟化酶報告了基因檢測實驗的過程。
實驗适用
1、驗證miRNA和mRNA是否互相靶向：将待測mRNA的3'UTR序列插入到報告基因載體中，然後轉移到miRNA中，如果熒光素酶的活性降低，則建議為其靶序列。相同的原理可用于驗證miRNA和lncRNA之間的靶向互相作用。
圖24 我們驗證了microRNA和mRNA互相靶向時載體的示意圖。圖檔來源：博源生物。
圖25 我們驗證了microRNA和lncRNA互相靶向時載體建構的示意圖。圖檔來源：博源生物。
2、驗證啟動子的活性：将待測啟動子建構到熒光素酶基因的上遊，檢測啟動子的活性。類似地，可以通過分割或突變啟動子區域來檢測啟動子活性。
圖26 我們驗證了當啟動子活動或啟動子的活動被截斷或突變時載體的結構示意圖。圖檔來源：博源生物。
3、驗證特定轉錄因子與其調控序列之間的互相作用：該序列（通常是啟動子區）進入報告基因載體，同時在實驗細胞中共表達轉錄因子，可以分析轉錄因子過表達是否增加或降低熒光酶的活性。
圖27 驗證特定轉錄因子與其調控序列之間互相作用時的載波構造示意圖。圖檔來源：博源生物。
圖28 我們的雙熒光素酶報告說，基因檢測實驗是空的，可以連接配接到要測試的起始序列。
圖29 我們的雙氟化酶報告了基因檢測實驗的空負載，可以連接配接到要測試的轉錄因子序列和要測試的miRNA序列。
圖30 我們的雙氟溶前體系統報告說，基因檢測實驗是空的，可以連接配接到要測量的mRNA的3'UTR序列。
圖31使用雙氟化素酶報告基因實驗驗證了轉錄因子AabHLH112與啟動子pAaERF1，pADS，pCYP71AV1，pDBR2和pALDH1之間的互相作用（Xiang，2019）。
雙"劍"組合-熒光素酶-報告基因檢測
點選了解雙熒光素酶實驗系統的原理
氟蛋白互相分析 - 使用熒光素酶作為報告基因
熒光素 - 鐵酶補體測定，LCA使用熒光素作為底物來檢測熒光素酶的活性。具體而言，來自生物來源的熒光素酶催化底物熒光被氧化，發出波長最強的約560nm的生物熒光。在實驗中，熒光素酶蛋白被切割成N面和C面的兩個功能片段，即NLuc和CLuc。在一個實驗系統中，待測的兩個靶蛋白與NLuc和CLuc融合，如果兩個靶蛋白互相作用，熒光素酶的NLuc和CLuc将在空間上足夠接近并正确組裝以發揮熒光素酶活性，即分解底物産生熒光。
圖32 熒光素酶蛋白互相分析實驗的原理。
圖33 在熒光素酶蛋白的互相分析實驗中檢測到APC10和DMS3與其突變蛋白之間的互相作用（Zhong等人，2019）。
圖34 在我們對熒光素酶蛋白的互相分析中連接配接到目标蛋白A的nLuc載體圖。
圖35 在我們的熒光素酶蛋白互操作性分析中連接配接到靶蛋白B的cLuc載體圖譜。
薄曉遠方
在本文中，曉媛主要談到了報告基因的主要類型、反常識知識和和平時期實驗的應用，希望對您有所幫助！
讓我們學習一些文章
引用
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