背景
报告的基因是一种易于检测的基因，在细胞、组织、器官或个体中表达。作为报告基因，必须满足的条件是其表达产物在受体细胞中没有背景表达，并且表达产物易于测量。
图1报告了基因系统，可以使用成分或诱导启动子驱动因素进行报告（Serganova和Blasberg，2019）。
猫基因
第一个报道的基因系统用于表征启动子的活性 - 将启动子元件连接到氯霉素乙酰转移酶CAT基因（Shaw等人，1979），将成功构建的质粒转染到靶细胞中，向培养基中加入14C-氯霉素，并检测提取物中乙酰化和非乙酰化14C-氯霉素的放射性，从而计算活酶的活性以表征启动子（An等人， 1982).
图2在CEF细胞中，转染了两个质粒PSV2cat和pRSVcat，并检测到CAT酶活性，并且在后者的实验条件下发现了更高的CAT酶活性（An等人，1982）。
GUS 基因
在攻读博士学位期间，杰斐逊开发了一种基于β-葡萄糖醛酸酶（β-葡萄糖醛酸酶，GUS，EC 3.2.1.31）的视觉报告系统（Jefferson等人，1986年，杰斐逊等人，1987年），该系统由大肠杆菌K-12的GUS基因编码。
GES组织化学测试：当与5-溴-4-氯-3-胶β胶质苷（X-Gluc）孵育时，该酶将X-Gluc代谢为蓝色产物。杰斐逊将这种历史方法应用于植物，因为在高等植物中没有可检测的GUS活性（Jefferson等人，1987）。随后，数以万计的实验室在植物生物学研究中使用了gus报告系统，并一直持续到今天。
GUS光谱检测：GUS可以与底物4-甲基伞状酮-β-葡萄糖酸盐（MUG）反应，产生荧光物质4-甲基伞状酮（MU），MU激发波长为365nm，发射波长为456nm，可以用分光光度计或酶计测量（Jefferson等人，1987）。
图3 光谱测量GUS（Jefferson等人，1987年）。131是指转移到pBI131载体（驱动GUS基因的rbbcS启动子）的材料，121是指转移到pBI121载体（驱动GUS基因的CamV 35S启动子）的材料。
LacZ基因
LacZ基因编码大肠杆菌水解酶β半乳糖苷酶（β-半乳糖苷酶，β-gal），其β-gal将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色物质5-溴-4-靛蓝（An等人，1982），其被广泛用作细菌，酵母和哺乳动物细胞的报告系统。
蓝白点筛选是使用此报告系统过滤重组物的一种方法。使用编码β-gal欧米茄片段作为宿主的菌株，以及将β-gal α片段编码为空载的质粒，多克隆位点（MCS）位于编码α肽链的区域，因此当空载转移到宿主细菌时，α Α片段和欧米茄片段相互补充以形成酶活性β-gal， 其中斑块在添加到X-gal的培养基上是蓝色的，并且由于靶基因的插入破坏了α片段，因此酶β-gal无法形成，因此重组物呈现白色。
图4 蓝白点屏蔽示意图。图片来源：DAWINBIO。
GFP基因
绿色荧光蛋白（GFP）首先从水母中分离出来（Shimomura等人，1962年），其中含有238种氨基酸，在激发光中发出绿色荧光。最令人惊讶的是，它的荧光染发簇是自发的（由Ser65-Tyr66-Gly67三肽自催化形成对羟基苯亚甲唑而产生），不需要额外的底物，酶和辅因子，这意味着蛋白质可以直接在任何生物体中表达和发光，因此GFP迅速成为细胞生物学和分子生物学中研究和使用最广泛的蛋白质之一。科学家Roger Y. Tsien，Osamu Shimomura和Martin Chalfie也因发现和修改GFP蛋白而获得2008年诺贝尔化学奖。
图5 GFP最初来自维多利亚水母（Aequorea victoria）。图片来源：维基百科。
图6 各种荧光蛋白。图片来源：维基百科。
表1 几种常见的荧光蛋白及其相对于野生GFP的突变位置。
转移到GFP的生物图7是美丽的隐藏线虫，果蝇，兔子，强奸，小鼠，斑马鱼，HeLa细胞，果蝇胚胎细胞，变形虫胚胎细胞和小鼠浦肯野细胞（Chalfie，2009）。
荧光素酶
萤火虫深深植根于中国文化，既是美国"氟雪囊"的传播，也是"银烛秋光冷屏，光罗小扇荧光"的杰作传播。
黑暗中的蘑菇。图片来源：Origami-Tumblr。
荧光素酶（Luc）是所有产生生物荧光的氧化酶的通用术语，与荧光蛋白发光机制不同，荧光素酶不需要外部光源，但需要添加称为荧光素的底物。
图8 生物荧光和荧光蛋白发光的区别。生物荧光是指荧光素-ATP-氧中的荧光素酶、Mg2加催化作用产生几种物质和光，荧光蛋白发光被激发光源激发后电子被激发到高能级，然后跃升到低能级的过程中发出比激发光波长更长的荧光。
最着名的发光生物是萤火虫，其次是真菌，如蘑菇，细菌和一些藻类。目前研究得很好的荧光素酶是一种来自萤火虫的荧光素酶和一种来自Renilla reniformis的荧光素酶。荧光素酶应用最广泛的实验是双荧光素酶报告基因检测实验，小原稍后将详细介绍。
图9 分别来自萤火虫、细菌和鞭打藻类的荧光素酶。
红宝石基因
要检测或染色GUS需要添加底物4-MUG或X-Gluc，观察GFP等荧光蛋白需要荧光激发，检测荧光素酶需要添加底物荧光素，多次样品会被检测或观察损坏，是否有非侵入性、连续和可视化的报告系统？
在甜菜和火龙果中看到的鲜红色是甜菜红积累的结果，而甜菜的生物合成已经得到很好的研究，只需三种酶促反应即可将酪氨酸转化为甜菜红素。在二元载体T-DNA上插入一个包含这三种酶（RUBY）的阅读框，而不是真核抗性筛选基因，并使用红色来表征转基因阳性愈合或植物（He等人，2020）。
图10将三个甜菜根生物合成基因组合到一个开放的阅读盒中，仅使用一个启动子和终止子，并在每个基因之间插入2A肽，翻译后，2A肽自我剪切，释放三种酶（He等人，2020）。
图11使用RUBY系统的转基因植物和愈合（He等人，2020年）。（a） CaMV 35S起动机驱动RUBY系统，右边是转基因变形虫;（b）泛素启动子驱动RUBY系统，右边是转基因变形虫;（c） 种子特异性启动子 At2S3 驱动 RU BY 系统，叶和茎无 RUBY 表达，种子中 RUBY 表达;（d） YUC4：红宝石植物在雌性叶子的尖端和顶部显示红色;和（e）DR5：RUBY在水稻愈合组织中表达;(f）与e-DR：eGFP;（g-h）DR5：RUBY与DR5：eGFP水稻根叶比较。
二
关于报告基因的一些反常识发现
由于一些报道的基因（如GFP）被广泛用于分子和细胞生物学，许多团队开始研究基因对受体细胞的影响。最早的研究表明，三种常见的野生GFP突变会促进细胞凋亡（Liu等人，1999）。在内皮细胞中，GFP本身选择性地诱导内皮细胞中某些基因的表达，例如通过以剂量依赖性方式检测GFP以诱导HSP70在转录和蛋白质水平上的表达（Zhang等人，2003）。在大鼠心肌细胞中，发现GFP的过表达会影响心肌细胞的收缩（Nishimura等人，2006）。增强的GFP（eGFP）在肌肉细胞中的表达损害了其收缩特性，因为eGFP与肌红蛋白头结合，从而干扰肌因子 - 肌红蛋白相互作用，这反过来又干扰肌肉细胞的收缩功能（Agbulut等人，2007）。在神经元中，由神经元特异性启动子thy1驱动的黄色荧光蛋白（YFP）的表达改变了神经元的细胞特征（Comley等人，2011）。利用全基因组DNA微阵列技术，研究了GFP对心肌细胞的影响，结果表明212个基因的表达发生了变化，其中174个被修饰，38个被修饰（Badrian bogoyevitch，2007）。分析GFP在稳定表达后对乳腺癌细胞蛋白质组学的影响发现，GFP可能对细胞量表的结构，细胞应激反应等产生影响（Coumans等人，2014）。
在植物领域，似乎对报告的基因进行的毒性研究很少。小媛在工作中被不少老师问及是否直接利用亚细胞定位载体做基因修饰表达实验，小媛会建议，在鉴定基因功能之前不要使用带有荧光蛋白或其他报道基因的载体进行基因修饰表达实验，以免报告基因的正常功能影响靶蛋白;例如，协同IP实验可用于蛋白质互测。
图12使用Co-IP技术检测RRS1和RPS4，RRS1B和RPS4B之间的相互作用（Saucet等人，2015）。这里小原还插了一个我们在做客户实验时经常发现的现象：在Co-IP实验中，发现使用GFP抗体会ip到多种蛋白质（如图2、3、5、6通道右侧），这是融合蛋白断裂后连接GFP的靶基因。
小原需要提醒大家，在基因功能研究中，转移到gFP和其他报告基因的受体细胞/组织必须谨慎对待作为对照测试结果，并且在基因功能不确定之前，应将具有报告基因的载体用作转基因载体。尽管在某些情况下，人们对报告的基因毒性存在一些担忧，但它仍然是最可靠和最易于使用的生物学研究方法之一。
三
报告基因在实验中的应用
亚细胞定位 - 以荧光蛋白为报告基因
亚细胞定位实验构建将靶基因的N面或C侧与荧光蛋白融合的载体，使用瞬时转化技术使用激光共聚焦显微镜（共聚焦显微镜）观察细胞内蛋白质的特定位置，例如在细胞核，细胞质，细胞膜或细胞器中。亚细胞定位实验包括常见定位实验、共定位实验和 BiFC 实验。
图13在原生质中观察到蛋白质的亚细胞定位（Liu等人，2020）。
图14 我们的亚细胞定位空pBWA（V）HS-gfp，载体有两个BsaI酶切割点，可以无缝连接靶基因。
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博晓源
闪亮的 GFP-GFP 报告基因
视频编号
组织表达分析 - 美元作为报告基因
靶基因的启动子与GUS报告基因连接，基因表达的强度和启动子的表达强度可以根据组织染色的结果来确定。
图15 GUS作为不同组织中基因表达模式基因分析的报告（Qin等人，2011）。
图16 我们的启动子分析了空的pBWA（V）H-gus，GUS基因5'端左酶切割位点，可以连接到靶基因启动子。
酵母双 - ADE2 ， HIS3 ， AUR1 - C ， MEL1 作为报告基因
酵母双重杂交是广泛用于大多数生物体破译基因功能和信号通路的强大工具。该方法出现于20世纪90年代，酵母双杂交是基于真核生物转移因子具有两个可分离的结构域，DNA结合域（结合domin，BD）和活性结构域（激活结构域，AD）的观察。DNA结合结构域负责转录因子在特定DNA序列上的结合，激活结构域的功能是激活基因的转录。BD和AD不一定必须存在于同一蛋白质中才能发挥作用，这两个结构域在物理上是分开的，当两个结构域非常接近时，发生靶基因的转录激活。因此，蛋白质之间相互作用的存在是通过测试报告的基因激活表达来表征的。
图17 我们的酵母单杂交诱饵载体。
图18 我们的酵母双杂交猎物载体。
图19 我们的酵母双杂交项目交付图。
酵母单蕊草 - AUR1-C作为报告基因
酵母单混的原理类似于双异质性，它将GAL4的DNA结合域替换成蛋白编码基因库，因此只要它表达的蛋白质与靶序列相互作用，它也可以通过转录激活域激活RNA聚合酶，并启动下游报告基因的转录。
图20 酵母单核化原理。
图21 我们的酵母单杂交诱饵载体。酵母单胎的猎物载体是双杂交的猎物载体。
图22酵母单细胞实验证明AaTCP14可以与DBR2和ALDH1启动子上的TCP结合位点（Ma等人，2018）结合。
双氟化酶报告遗传检测系统 - 使用荧光素酶作为报告基因
双荧光素酶报告基因检测系统（双荧光素酶报告基因检测）：在单荧光素酶检测系统（仅限萤火虫荧光素酶）的基础上，引入海洋肾荧光素酶基因，消除不同组间细胞生长、细胞计数和转染效率的干扰，使实验结果更加可靠。
图23 双氟化酶报告了基因检测实验的过程。
实验适用
1、验证miRNA和mRNA是否相互靶向：将待测mRNA的3'UTR序列插入到报告基因载体中，然后转移到miRNA中，如果荧光素酶的活性降低，则建议为其靶序列。相同的原理可用于验证miRNA和lncRNA之间的靶向相互作用。
图24 我们验证了microRNA和mRNA相互靶向时载体的示意图。图片来源：博源生物。
图25 我们验证了microRNA和lncRNA相互靶向时载体构建的示意图。图片来源：博源生物。
2、验证启动子的活性：将待测启动子构建到荧光素酶基因的上游，检测启动子的活性。类似地，可以通过分割或突变启动子区域来检测启动子活性。
图26 我们验证了当启动子活动或启动子的活动被截断或突变时载体的结构示意图。图片来源：博源生物。
3、验证特定转录因子与其调控序列之间的相互作用：该序列（通常是启动子区）进入报告基因载体，同时在实验细胞中共表达转录因子，可以分析转录因子过表达是否增加或降低荧光酶的活性。
图27 验证特定转录因子与其调控序列之间相互作用时的载波构造示意图。图片来源：博源生物。
图28 我们的双荧光素酶报告说，基因检测实验是空的，可以连接到要测试的起始序列。
图29 我们的双氟化酶报告了基因检测实验的空负载，可以连接到要测试的转录因子序列和要测试的miRNA序列。
图30 我们的双氟溶前体系统报告说，基因检测实验是空的，可以连接到要测量的mRNA的3'UTR序列。
图31使用双氟化素酶报告基因实验验证了转录因子AabHLH112与启动子pAaERF1，pADS，pCYP71AV1，pDBR2和pALDH1之间的相互作用（Xiang，2019）。
双"剑"组合-荧光素酶-报告基因检测
点击了解双荧光素酶实验系统的原理
氟蛋白相互分析 - 使用荧光素酶作为报告基因
荧光素 - 铁酶补体测定，LCA使用荧光素作为底物来检测荧光素酶的活性。具体而言，来自生物来源的荧光素酶催化底物荧光被氧化，发出波长最强的约560nm的生物荧光。在实验中，荧光素酶蛋白被切割成N面和C面的两个功能片段，即NLuc和CLuc。在一个实验系统中，待测的两个靶蛋白与NLuc和CLuc融合，如果两个靶蛋白相互作用，荧光素酶的NLuc和CLuc将在空间上足够接近并正确组装以发挥荧光素酶活性，即分解底物产生荧光。
图32 荧光素酶蛋白相互分析实验的原理。
图33 在荧光素酶蛋白的相互分析实验中检测到APC10和DMS3与其突变蛋白之间的相互作用（Zhong等人，2019）。
图34 在我们对荧光素酶蛋白的相互分析中连接到目标蛋白A的nLuc载体图。
图35 在我们的荧光素酶蛋白互操作性分析中连接到靶蛋白B的cLuc载体图谱。
薄晓远方
在本文中，晓媛主要谈到了报告基因的主要类型、反常识知识和和平时期实验的应用，希望对您有所帮助！
让我们学习一些文章
引用
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