了解高通量測序技術和單細胞測序技術（自用）

首先明确單細胞測序技術不一定是高通量的，有單細胞測序技術，高通量測序技術，包括高通量測序技術在内的所有高通量技術，用于單細胞測序的高通量技術。

如果我們要從技術層面了解單細胞測序并分析其優勢，就必然繞不開對“單細胞測序”“高通量技術”等概念的準确的把握。我們必須搞清楚，當一種技術前面帶了“單細胞”（Single-cell）或“高通量”（High-throughput）的字眼時，它們分别代表了什麼。

單細胞，就是單個（僅一個）細胞的意思。針對單個細胞展開的分析統稱為單細胞分析（Single-cell analysis），針對單個細胞進行的測序就是單細胞測序（Single-cell sequencing），如果是對多個細胞或者一群細胞的測序，就不是單細胞測序。比如面向大衆的那種測着玩兒的基因測序，一般是取待測者的血液，做簡單的處理後就直接提取某些DNA片段。至于提取到的是這一個白細胞裡的，還是那個白細胞的，又或是血液中的遊離DNA，就無進而知了。又比如一般的惡性良性腫瘤研究，通常是對惡性良性腫瘤組織分離出來的為數不少的惡性良性腫瘤細胞測序。單細胞測序是一種特殊的測序；目前，大部分的測序都不是單細胞層面上的測序。

高通量又是什麼意思呢？通量，你可以了解為一次實驗時 獨立的、平行的 反應的數目。這些反應是在不同的容器或反應器裡的，彼此獨立，互不幹擾；但又是在相同的環境裡同時（或幾乎同時）進行的，是以說是平行的。假設我們對細胞進行分析，下圖中的試劑與細胞中的某種成分進行反應。

（為了友善，隻畫了28個平行反應，實際上在高通量技術領域，28的通量實在不算高。）

高通量技術存在的意義，我認為主要在于它有效地節省了某個實驗對人力物力财力的耗費。另外，同樣的反應同時展開三個以上，可以消除随機性對反應結果的影響，進而得到較為嚴謹的反應結果。

比較原始的實作高通量的方式，是實驗室苦力們用雙手操作移液槍，在96孔闆或384孔闆裡加各種試劑。但手動操作的局限性很大，速度也很有限。很有可能加到第100個反應的時候，第100個反應剛開始，第1個反應已經結束了。這樣，這兩個反應還能稱得上是平行的嗎？手動操作達不到很高的通量，于是高通量技術逐漸地向機械化、自動化的方向發展。市面上也早已有不少的液體操作機器人或點樣儀。它們就具備這樣的能力。

右圖是96孔闆，有這種底的，也有圓柱體、平底的。

高通量技術是一種具有普适性的、應用範圍（可以）很廣的技術。理想狀況下，未來很多的實驗，尤其是生命科學領域那種涉及大量的加液、加液、加液的重複性操作的實驗都應該往高通量的方向發展，這樣可以解放科研工作者的雙手，讓他們把精力留給思考，和真正的科研。就先不提測序，舉個例子，高通量篩選（High-throughput screening，HTS）。

高通量篩選技術在藥物篩選領域有着不可忽視的應用價值。要知道，一種藥物從合成到真正應用到臨床的周期有多麼漫長。在應用到人體之前，藥物不僅要經過分子層面的表征，還需要通過細胞實驗和動物實驗。細胞實驗時，不僅要對藥的效果進行驗證，對藥物本身進行篩選，還需要在衆多條件中篩選出最佳的給藥條件。這個過程非常地laborious，也非常地昂貴。高通量篩選技術可以縮短篩選所需的時間，提高篩選效率。比如要從含有300種分子的文庫（library）中篩選出真正有效的藥物。如果高通量技術能同時進行900個平行反應（每種分子對應3個反應），那麼，篩選就可以一次完成。

高通量測序（High-throughput sequencing）

二代測序（Next-generation

sequencing）是目前最常用的測序技術，像Illumina的那些測序儀的測序原理就屬于二代測序的範疇。二代測序是在人類基因組計劃（Human

genome project，HGP）的背景下發展起來的，是大規模平行的（Massively parallel），寄托了人們對 $1,000

genome（把一個人類個體的全基因組測序費用降低到1000美元）的期望。二代測序基本上等同于高通量測序，其最大的意義與其他高通量技術的意義相統一，就是大幅度降低成本，提高效率。

不同的二代測序技術實作高通量的方式有所不同。比如，454測序技術[1]（後被羅氏收購，現已淘汰）把DNA碎片化，得到DNA片段（DNA

fragments）并使之變為單鍊之後，用磁珠捕獲這些DNA片段，確定one fragment per

bead。然後将這些磁珠包裹到含有PCR試劑的液滴中，進行PCR反應，以擴增磁珠上的DNA片段。由于液滴是由油相間隔開的，互不幹擾，是以液滴相當于是微反應器（容納PCR反應的微型容器），而這樣的基于液滴的PCR反應是高通量的（不同液滴中的PCR反應是獨立、平行的反應）。液滴中擴增的DNA片段也被捕獲在磁珠上。之後，該測序方法會使液滴破裂，收集所有的磁珠，并将磁珠分散到不同的微坑之中，對這些磁珠進行同時的、高通量的測序。

而目前最常用的Illumina測序儀所采用的Solexa測序技術與之不同，不需要用到磁珠，過程相對簡單。它會事先地在晶片内通道的底部修飾兩種被稱作接頭（Adapter）的寡核苷酸，其分别與DNA片段兩端接上的兩段核苷酸互補。然後進行橋式PCR，在這種擴增方式中，以待測DNA片段為模闆合成的DNA鍊由于離通道底部較遠的一端與附近的接頭互補，會向該接頭彎曲，并形成“一座橋”（橋式擴增以此得名），然後DNA聚合酶以這座橋為模闆形成新的鍊。這樣的過程不斷重複，最後成簇。由于橋式擴增裡，某一條DNA鍊隻能和最近的接頭形成“橋”，是以這些以同一條DNA鍊為模闆合成的DNA鍊隻會局限在局部，形成密密的一小撮，是以說是“成簇”。不同的待測DNA鍊在不同的位置形成不同的簇（Cluster），起到了聚集并放大信号的作用。

Illumina測序的橋式擴增

單細胞測序（Single-cell sequencing） 由于高通量測序是目前最常用的測序技術，單細胞測序用的測序技術自然也以高通量測序技術為主。然而，單細胞測序并不在高通量測序技術及其測序儀上做文章，它的難點以及和普通測序的不同之處主要在于測序前的前處理，包括 單細胞的捕獲，目标DNA/RNA的提取，微弱信号的放大（即極少量DNA鍊的擴增）等等 。

難點1：單細胞捕獲。如何将細胞分散到獨立的容器或反應器中去，讓它們彼此獨立，互不幹擾？

難點2：目标DNA/RNA的提取。提取不是問題。問題在于，提取時怎樣讓待測DNA或RNA帶上不同的标記，以便測序完了以後還能分辨出來哪些序列是屬于同一個細胞的？

難點3：信号放大。實際測序時，裂解一群細胞所得到的待測DNA含量都是很低的。目前的測序都含有PCR擴增這一步，而且這一步顯得相當重要。更何況是一個細胞？一個細胞中的DNA或RNA簡直太少了，稍一操作就可能丢失。怎麼樣能盡量地減少樣品損失和擴增時發生的偏移和錯誤呢？

我個人的研究方向是微流控（Microfluidics）。微流控技術具有精确操控微量液體的能力，是一種适合應用于單細胞分析領域、而且已經在這方面展現了自身價值的技術。就在這個問題提出之後，沒過多少天，2015年5月21日，同一期Cell上發表了兩篇相似的、利用微流控技術來實作單細胞捕獲的文章[2,3]。它們均采用了微流控領域中經典的十字形通道構型。如Drop-seq（下圖左），在主通道内引入了含有磁珠和逆轉錄所需試劑的溶液，與之垂直的第一組側通道引入了細胞懸液，第二組側通道則引入了與溶液不相溶的油相（如礦物油）。油相對水相的切割作用使溶液被“夾斷”，進而形成球形的液滴。液滴對磁珠和細胞的包裹基于泊松分布的原理，也就是說，磁珠和細胞是随機地被包裹在液滴中的，但我們可以根據泊松分布，通過稀釋磁珠懸液和細胞懸液的密度，以盡可能降低液滴包裹兩個（或多個）細胞或兩個（或多個）磁珠的機率，并達到較高的單磁珠單細胞的捕獲機率。雖然這種捕獲方式無法達到很高的捕獲機率，但鑒于液滴生成的速度非常快（大于100,000/min），是以實作了非常高的通量。

液滴的角色是微反應器，你可以把這些不可計數的體積很小（納更新）的液滴想象成是一種球形的、柔軟的容器。隻不過間隔這些容器的不是離心管壁，不是塑膠，而是與液滴不相容的油。但這種“容器”畢竟沒有那麼穩定；而且向這些已經形成的液滴中加入其餘新的試劑，那是一件非常難的事情。是以這裡借助了磁珠的作用。 磁珠上修飾了引物，引物上除了含有一段通用的PCR引物，還有一段cell barcode，即細胞标記（用來标記每個細胞的來源,不同的細胞有不同的barcode），同一個磁珠上的引物帶有相同的cell barcode，而不同磁珠之間的barcode則是不同的。另外一段UMI（Unique molecular identifier），是用來标記分子的，每一條引物都有它特定的UMI(标記mRNA 用處：PCR擴增之前的重複需要保留，PCR擴增之後的重複需要去除。怎麼實作呢？UMI(Unique Molecular Identifier)數字标簽技術這時候就派上用場了，隻要在PCR擴增之前給每個分子加上一個特有的标簽，之後無論經過多少個循環的擴增，這個标簽都一直伴随着同步進行複制，最後可以通過UMI的種類對真重複和假重複進行區分，進而達到去除擴增重複的目的)。 當一個磁珠和一個細胞被包裹于一個液滴微反應器中，液滴中含有的細胞破膜劑使細胞破裂，釋放其内容物，磁珠即捕獲了該細胞的某些RNA。之後就隻需取出這些磁珠，對這些磁珠進行逆轉錄、PCR擴增、測序等過程。由于每條分子都已經含有UMI和cell barcode，這些操作都可以用正常的方式，在離心管中統一進行。

這兩篇是單細胞RNA測序，而單細胞DNA測序面臨更嚴重的樣品太少、容易損失的問題。單細胞DNA測序對于擴增方法的均勻性和準确性有更高的要求，在這方面微流控技術也發揮了它的作用。比如2015年9月發表在PNAS上的一篇文章[4]，先是用顯微操作取了一個細胞到小離心管裡，使細胞裂解。然後也用十字形微流控通道使單細胞裂解産物生成液滴，并盡量保證每個液滴中含有0或1條DNA分子。将DNA分子分散到獨立的液滴微反應器之後再進行的擴增反應具有更好的均勻性，更有利于單細胞全基因組測序。

以上是背景。現在我再來正面回答一下這個問題。

單細胞測序具有諸多的難點，涉及到一系列不同的技術，它更多地是代表了一種研究方向。我們隻有在讨論某一項具體的技術或産品時才會去比較它的優勢和劣勢。

對于單細胞測序，我們似乎更應該着眼于它的“研究意義”和“研究價值”。單細胞測序那麼難做，為什麼還要去做它呢？實際上，包括單細胞測序在内的單細胞分析的意義，現在還存有争議。我就認識一位老師，他不太認同單細胞分析的意義，覺得沒必要對單個細胞進行如此深入的分析。但随着單細胞相關的研究越來越普遍，越來越深入，應該會有越來越多的人認可它的意義。

單細胞測序的意義的根本在于細胞的異質性（Heterogeneity）。就是說，細胞與細胞之間存在個體差異性，即便是出于同一位置的細胞，也可能在基因表達等方面存在一些差異。對細胞群體的研究，隻能得到這群細胞平均化的結果。而這結果是掩蓋了細胞異質性的。兩個具體的例子。

一是細胞分類。那篇Drop-seq的切入點就是細胞分類系統。以往我們在對細胞進行分類時，往往依據的是細胞的空間位置、形态等特性，這種分類方式相當地簡單粗暴。進行單細胞水準的RNA測序或DNA測序，有助于實作更為細緻和嚴謹的細胞分類，尤其是對于比較複雜的組織，單細胞測序能促進人們更深入地了解細胞與細胞的功能。

二是惡性良性腫瘤相關的研究。現在一個認可度比較高的關于惡性良性腫瘤轉移的假說是，惡性良性腫瘤上某些細胞會從原位脫落，進入血液循環，成為循環惡性良性腫瘤細胞（Circulating tumor cells，CTCs）。有些CTCs可能會順着血液流到某個器官，侵入血管，侵襲該器官，附着，增殖，長出新的惡性良性腫瘤。那麼，原來那顆惡性良性腫瘤裡哪些細胞會成為CTCs，而CTCs中哪些可以在血液循環中存活下來，并且完成惡性良性腫瘤轉移呢？這些具備超乎尋常的能力的CTCs和尋常的CTCs之間有什麼差別？這就需要單細胞層面上的測序和其他相關研究了。

目前，單細胞測序或其他的單細胞研究看似是不太“實用”的研究方向。但它代表着人們已經注意到了細胞的異質性，開始關注細胞個體而非群體，代表了一種更深入的視角，一種更精準地了解生命的可能性。僅從這個方向來想，其實，我就覺得它夠有意義的了。

參考文獻：

[1] M. Margulies, et al., Genome sequencing in microfabricated

high-density picolitre reactors, Nature 437 (2005) 376–380. [2] Macosko, E.Z., et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. CELL, 2015.161(5): p. 1202-1214.

[3] Klein, A.M., et al., Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells. CELL,

2015. 161(5): p. 1187-1201.

[4] Fu, Y., et al., Uniform and accurate single-cell sequencing based on emulsion whole-genome amplification.

PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES

OF AMERICA, 2015. 112(38): p. 11923-11928.編輯于 2019-08-12

作者：董阿橘 連結：https://www.zhihu.com/question/30307493/answer/784368455

來源：知乎