小麥生産受到白粉病、鏽病、赤黴病等多種真菌性病害的威脅，從小麥及其親緣物種中發掘和利用有效的抗病基因對控制病害具有重要意義。高大山羊草（Aegilops longissima，2n = 14，SlSl）是小麥族山羊草屬二倍體物種，與小麥的B基因組祖先高度相關，它能抵禦小麥多種病害，是小麥遺傳改良的重要資源。從20世紀80年代開始，Ceoloni、Cenci、Donini等人将高大山羊草的白粉病抗性導入小麥，創制了一系列小麥-高大山羊草易位系。後來，高大山羊草的這個抗白粉病位點被命名為Pm13。Pm13是已報道的抗白粉病基因中仍保持良好抗性的基因之一，且攜帶Pm13的易位系沒有明顯的連鎖累贅，然而它在小麥抗病育種中受到的關注不多。本研究利用輻照誘導的感病缺失系對Pm13進行實體定位，利用EMS誘導的感病突變體進行轉錄組測序分析，鑒定和克隆了Pm13基因，經瞬時表達和轉基因分析驗證了它的抗白粉病功能。本研究還利用煙草和小麥葉片原生質體瞬時表達技術揭示了Pm13編碼的新型融合蛋白的生化功能。
（1）攜帶Pm13的易位系對108個白粉菌菌株具有良好抗性
No.3778為攜帶Pm13基因的小麥-高大山羊草易位系，我們采用ND-FISH技術對攜帶Pm13的易位系No.3778的染色體組成進行鑒定，證明No.3778攜帶一對易位染色體3SlS-3BS.3BL，其中外源片段3SlS位于小麥染色體3BS的末端（圖1a）。随後檢測了該易位系對108個白粉菌菌株（包括101個來自中國的菌株和7個來自歐洲的菌株）的抗性反應，結果表明，一葉期的No.3778（Pm13）對測試的所有菌株都表現為免疫（IT 0）（圖1b）。在2019-2022年小麥生長季節，田間種植的No.3778對強毒菌株Bgt YZ01具有良好的成株抗性。
圖1 廣譜抗白粉病基因Pm13的實體作圖（2）Pm13的遺傳分析 将抗病的No.3778（Pm13，IT 0）與感病的徐麥44（XM44，IT 4）雜交，建構遺傳作圖群體。抗病性鑒定顯示，F1的反應型為IT 1，F2群體中238株分離出182個抗病單株（IT 0或1）和56個感病單株（IT 4），符合3:1的分離比例，說明No.3778對Bgt YZ01的苗期抗性由一個不完全顯性基因控制（可能受基因劑量的影響）。 根據3SlS染色體末端0-22 Mb區域中的單拷貝或低拷貝的高大山羊草基因開發了37個多态性分子标記，其中4個為共顯性分子标記（X1650、X3140、X3990和X5730），跨越16 Mb的範圍，利用這4個标記進行遺傳分析，在F2群體中沒有檢測到3SlS染色體和小麥3BS染色體之間的交換事件，這說明Pm13所在區域存在交換抑制，這限制了圖位克隆技術的應用。（3）利用輻射誘導的染色體缺失對Pm13進行實體定位 利用60Co-γ射線輻照No.3778種子，從424個M2家系中鑒定出10個感白粉病突變體（m1-m10）（圖1c）。用開發的37個分子标記對這些感病突變體進行分析，發現了8種類型的染色體結構變異，代表着不同大小的染色體片段缺失。在m1-m3中，所有标記都沒有擴增産物，表明3SlS的整體缺失。m4和m5在近端分别存在不同大小3SlS染色體片段缺失，染色體斷點兩側的标記分别為X2410/X2250和X2150/X2250。m7-m10在3SlS遠端存在片段缺失，斷點兩側的标記分别為X4150/X4220、X3940/X3990、X3410/X3940和X2770/X2820。突變體m6的染色體缺失範圍在分子标記X2020/X2150和X4150/X4220之間（圖1d）。綜上，Pm13被定位到分子标記X2410和X2820之間，實體距離約為0.74 Mb。（4）利用EMS誘導的感病突變體進行轉錄組測序分析，鑒定MLKL-K為Pm13候選基因 使用EMS處理No.3778種子，收獲了326個M2家系，從中篩選到6個抗白粉病功能喪失突變體（m11-m16）。Bgt YZ01接種後，對野生型（WT）No.3778和6個突變體的葉片進行轉錄組測序，将突變體的reads映射到野生型No.3778的轉錄組組裝，鑒定到了一個2006 bp的轉錄本，命名為NODE_25350_length_2006_cov_24.294361_g11779_i0（簡稱為NODE_25350），它在5個突變體中含有EMS型點突變（G>A或C>T）（圖2a）。
圖2 Pm13候選基因的鑒定與功能驗證
在高大山羊草參考基因組AEG-6782-2和TL05中都未發現與NODE_25350對應的注釋基因。然而，在AEG-6782-2中，一個未組裝序列（chrUn:3,336,888–3,345,975 bp）與NODE_25350高度同源，核苷酸序列一緻性高達98.7%。根據NODE_25350開發了分子标記XMLKL-K，它在野生型No.3778中有特異性擴增産物，而在感白粉病突變體m1-m10中沒有，這表明，NODE_25350位于Pm13所在的實體區間。 基于NODE_25350和含S基因組的山羊草屬物種的保守序列設計引物，從No.3778中分離到一個11376 bp基因組片段（OR052510），它包含了2637 bp啟動子、由7個外顯子和6個内含子組成的6554 bp編碼區和1932 bp終止子。對No.3778的cDNA進行RT-PCR擴增和Sanger測序，發現所得序列與NODE_25350完全一緻。NODE_25350的開放閱讀框（ORF）為1431 bp，編碼476個氨基酸。編碼蛋白包含一個N-末端的混合譜系激酶結構域樣假激酶（Mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL_NTD）結構域和一個C-末端的絲氨酸/蘇氨酸激酶（Serine/threonine kinase，STK）結構域，因而将候選基因命名為MLKL-K。通過Sanger測序驗證了5個EMS誘導的感病突變體的MLKL-K激酶結構域中都存在單個氨基酸替換（m11：G401D、m12：G308E、m13：G231R、m15：P461L和m16：C334R）（圖2b），而m14中MLKL-K的CDS沒有發生變異，其抗白粉病功能喪失可能和調控區或其他與Pm13抗性相關的基因的突變有關。（5）瞬時表達和穩定的轉基因分析證明MLKL-K具有白粉病抗性
為了驗證MLKL-K的功能，建構了由Ubi啟動子驅動的pUBI-MLKL-KCDS超表達載體，分别以含有Pm21的表達載體和空載體作為陽性對照和陰性對照，使用基因槍法将重組質粒和報告載體pUBI:GUS的混合物共轉化到感病小麥XM44葉片中。在轟擊後4小時用白粉菌菌株E09接種葉片，并在48小時後用GUS溶液染色，統計吸器指數。結果表明，在XM44表皮細胞中瞬時表達MLKL-K的吸器指數為36.8%，顯著低于空載體對照（67.5%），而表達Pm21的陽性對照的吸器指數為33.7%（圖2c-2d）。這說明MLKL-K的瞬時超表達在抵禦小麥白粉菌的侵染過程中發揮了作用。
為了進一步驗證MLKL-K的抗白粉病功能，建構了含有自身啟動子和終止子的轉基因載體pLGY-03-MLKL-K，然後使用農杆菌介導法轉化高感白粉病的小麥品種Fielder，共獲得了7個獨立的MLKL-K陽性轉基因植株。使用分子标記XMLKL-K進行檢測，7個T0轉基因植株都含有MLKL-K。用Bgt YZ01進行接菌鑒定，轉基因植株都表現出免疫反應。衍生的7個T1家系，在接種Bgt YZ01後表現出抗、感分離（圖2e-2f）。分子标記分析表明，MLKL-K存在與否與植株的抗感表型是吻合的。此外，還對2個T1家系中的陽性植株進行抗譜分析，它們對20個白粉菌菌株都具有高度抗性。由此得出結論，MLKL-K就是目的基因Pm13。初步觀察表明，Pm13的表達對轉基因植株的生長發育沒有明顯的負效應（圖3）。
圖3 Pm13轉基因植株（6）煙草和小麥原生質體生化分析揭示了MLKL-K處于失活的自抑制狀态 在煙草和小麥原生質體中的亞細胞定位分析表明，MLKL-K主要在細胞質和細胞核中積累（圖4）。用生長一周的No.3778和感病對照XM44接種白粉菌菌株E09，48小時後進行DAB染色和台盼藍染色，結果發現，No.3778表皮細胞在白粉菌侵染位點出現明顯的H2O2的積累和細胞死亡現象（圖5），這意味着MLKL-K可以通過激活H2O2的積累、引發宿主細胞死亡來阻止白粉菌的定殖。
圖4 MLKL-K的亞細胞定位
圖5 MLKL-K在白粉菌誘導的小麥葉片中引發H2O2積累和細胞死亡 為了在生化水準上研究MLKL-K的抗性機制，首先使用AlphaFold v2.0來預測MLKL-K編碼蛋白質的三維結構。該蛋白含有一個由四螺旋束（four-helix bundle，4HB）組成的N-末端MLKL_NTD結構域，一個起連接配接作用的含3個α螺旋的支架環（Brace）和一個C-末端絲氨酸/蘇氨酸激酶（STK）結構域（圖6a）。接着建構了含有全長MLKL-K和不同截斷短片段的載體，轉入農杆菌後分别注射到本氏煙草葉片中，随後進行台盼藍染色觀察。研究發現，隻有Brace-kinase122-476能夠導緻強烈的細胞死亡，而全長蛋白和單獨的結構域或區段都不能引起細胞死亡。作為對照，Brace-kinase122-476D367A（突變位點在激酶的ATP結合口袋）不能引起細胞死亡（圖6b-6d）。同樣，5個EMS誘導的感病突變體中的變異Brace-Kinase122-476（G231R、G308E、C334Y、G401D和P461L）也不能引發細胞死亡（圖7）。這些結果表明，Brace-kinase122-476誘導的細胞死亡依賴于功能性激酶結構域，并與它對小麥白粉病的抗性有關。
圖6 Pm13編碼的MLKL-K的結構與功能分析
圖7 MLKL-K的突變導緻喪失細胞死亡活性 通過煙草實驗發現細胞死亡強度可能與Brace區的α螺旋的數目有關。接下來利用小麥原生質體瞬時表達技術對細胞死亡強度進行了定量分析，結果表明，含有3個α螺旋的激酶結構域（α1-α2-α3-kinase160-476）誘導的細胞死亡水準與Brace-kinase122-476相當，且顯著高于含有2個α螺旋的激酶結構域（α2-α3-kinase174-476），而隻有1個α螺旋的激酶結構域（α3-kinase194-476）喪失了引發細胞死亡的能力（圖6d-6e）。這些結果表明，MLKL-K介導的細胞死亡不僅與功能性激酶結構域有關，也與Brace區的3個螺旋有關。激酶的活化通常依賴于自身的二聚化和磷酸化，Brace區的3個螺旋可能會促進MLKL-K激酶結構域的二聚化和活化。在缺少病原菌的情況下，全長MLKL-K不能誘導細胞死亡，這表明MLKL_NTD結構域可能阻止激酶結構域的二聚化并維持失活狀态。
Pm13/MLKL-K與拟南芥、動物MLKL蛋白具有類似的結構：MLKL-Brace-Kinase。但是，Pm13的MLKL_NTD與拟南芥的MLKL并無明顯的同源性，且分别屬于MLKL_NTD（CCD cd21037）、DUF1221（CCD cl06017）這兩個不同的保守域。拟南芥和動物MLKL蛋白都是假激酶，拟南芥的MLKL-Brace負責執行細胞死亡功能，小鼠的MLKL結構域能單獨引發細胞死亡。與之不同的是，Pm13/MLKL-K是真激酶，由具有N端α螺旋的激酶結構域負責執行細胞死亡功能，MLKL_NTD和MLKL-Brace都不會激起細胞死亡。由此可見，Pm13編碼的MLKL-K在結構和功能上都具有獨特性。
（7）MLKL-K/Pm13起源于最近的激酶和MLKL_NTD結構域的融合事件 利用MLKL-K/Pm13的MLKL_NTD結構域的氨基酸序列，對小麥族物種和其他植物的蛋白質組進行BLAST分析，并通過NCBI保守結構域的搜尋對比對的蛋白質進行注釋。我們發現植物界存在多種類型的含有MLKL_NTD的蛋白質。MLKL_NTD-PLAC8（MLKL_NTD與PLAC8結構域融合）是植物中最常見的類型，廣泛分布于裸子植物、雙子葉植物和單子葉植物中。隻有在禾大學植物中，我們發現了其他類型的含有MLKL_NTD結構域的蛋白質，包括含有單個MLKL_NTD結構域或兩個串聯MLKL_NTD結構域的蛋白質、MLKL_NTD融合STK（MLKL-K-like蛋白）、WD40、BRX、NLR等結構域的蛋白質。這表明了禾大學植物中含有MLKL_NTD結構域的蛋白質的快速進化。此外還發現，MLKL-K-like蛋白家族可能已經擴充并成為小麥族中包含MLKL_NTD結構域的蛋白的主要類型（每個物種包含11至34個成員）。基于激酶結構域的系統發育分析表明，MLKL-K-like蛋白聚集在3個不同的分支中，表明在禾大學植物的進化過程中，激酶與MLKL_NTD結構域的融合至少獨立發生了3次。作為一次融合事件，MLKL-K/Pm13及其直系同源物僅在含S基因組的山羊草屬物種中發現，它們都是由S基因組中的單拷貝基因編碼，而其他兩個融合事件出現在不同的禾大學植物中（圖8）。這些表明MLKL-K/Pm13及其直系同源基因起源于一個相對較新的kinase-MLKL_NTD融合事件。
圖8 Pm13編碼的MLKL-K起源于新的kinase-MLKL_NTD融合事件 總結而言，這項研究成功克隆了來源于高大山羊草的廣譜抗白粉病基因Pm13，并揭示了其編碼的激酶融合蛋白的生化功能和進化特性，有助于促進Pm13在小麥抗白粉病育種中的應用，也為進一步解析Pm13介導的白粉病抗性的分子機理奠定了基礎。 2024年8月2日，上述研究成果以“A kinase fusion protein from Aegilops longissima confers resistance to wheat powdery mildew”為題發表于《Nature Communications》雜志。江蘇大學何華綱副教授為第一作者兼通訊作者，研究所學生陳昭昭為共同第一作者，中國科學院分子植物科學卓越創新中心王亞軍研究員為共同通訊作者。中國科學院遺傳與發育生物學研究所沈前華研究員課題組、四川農業科學院張潔研究員、江蘇大學朱姗穎副教授、河南大學高安禮副教授、湖北省農業科學院龔雙軍研究員、中國農業科學院李洪傑研究員、沙特阿蔔杜拉國王科技大學Simon G. Krattinger教授等參與了該研究。這項研究得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金面上等項目資助。
文章連結：Huagang He, Zhaozhao Chen, Renchun Fan, Jie Zhang, Shanying Zhu, Jiale Wang, Qianyuan Zhang, Anli Gao, Shuangjun Gong, Lu Zhang, Yanan Li, Yitong Zhao, Simon G. Krattinger, Qian-Hua Shen, Hongjie Li & Yajun Wang. A kinase fusion protein from Aegilops longissima confers resistance to wheat powdery mildew. Nature Communications. 2024, 15: 6512.
http://www.nature.com/articles/s41467-024-50909-6
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