引用格式
王輝, 陳睿鵬, 餘志雪, 賀越, 張帆, 熊本海. 基于卟啉和半導體單壁碳納米管的場效應氣體傳感器檢測草莓惡疫黴[J]. 智慧農業(中英文), 2022, 4(3): 143-151.
WANG Hui, CHEN Ruipeng, YU Zhixue, HE Yue, ZHANG Fan, XIONG Benhai. Porphyrin and semiconducting single wall carbon nanotubes based semiconductor field effect gas sensor for determination of phytophthora strawberries[J]. Smart Agriculture, 2022, 4(3): 143-151.
基于卟啉和半導體單壁碳納米管的場效應氣體傳感器檢測草莓惡疫黴
王輝1， 陳睿鵬1， 餘志雪1， 賀越1，2， 張帆1，2， 熊本海1*
（1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所 動物營養國家重點實驗室，北京 100193；2.中國農業大學 動物科技學院，北京 100193）
摘要： 草莓惡疫黴會引起草莓革腐病和冠腐病，影響草莓的經濟效益，但感染惡疫黴早期植株沒有明顯的症狀，無法被及時準确地診斷，是以迫切需要低成本診斷方法實作早期預防。草莓植株感染惡疫黴會釋放一種獨特的有機揮發性氣體4-乙基苯酚，可作為該疾病快速診斷的标志性氣體。本研究使用半導體單壁碳納米管（Single-Wall Carbon Nanotube，SWNT）和場效應傳感器（Field Effect Transistor，FET）制備半導體場效應氣體傳感器（SWNT/FET），進而修飾對4-乙基苯酚靈敏度高、選擇性好的金屬卟啉MnOEP獲得MnOEP-SWNT/FET。通過拉曼光譜、紫外光譜、伏安分析法研究MnOEP-SWNT/FET，分析理化性能及優化檢測條件，提高MnOEP-SWNT/FET對4-乙基苯酚的氣體敏感性能。在最優檢測條件下，MnOEP-SWNT/FET對0.25%~100%的4-乙基苯酚飽和蒸汽（20 ℃），檢出限為0.15%的4-乙基苯酚飽和蒸氣（S/N =3），測定不同濃度的相對标準誤差低于10%。通過測定實際樣本，表明MnOEP-SWNT/FET檢測草莓健康植株會存在假陽性，但對感染惡疫黴的草莓植株有較高的檢測精度。
關鍵詞： 草莓；真菌感染檢測；氣體傳感器；納米複合材料；場效應半導體；4-乙基苯酚；半導體單壁碳納米管；場效應傳感器
全文
1
引 言
惡疫黴（Phytophthora cactorum， P. cactorum）是一種壞性極強的植物病原真菌，草莓植株感染惡疫黴會引起革腐病和冠腐病。統計表明，感染惡疫黴草莓植株果實産量平均下降20%~30%，部分可達50%，嚴重影響草莓果實産量。是以，惡疫黴已成為草莓産業發展的主要病害。
由于草莓惡疫黴缺乏低成本的治療手段，快速準确診斷該病原真菌對預防由其引起的疾病擴散、控制疾病、減少種植戶的損失具有重要意義。目前，正常的診斷方法有組織分離法、顯微鏡分析法、聚合酶鍊式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）、擴增（聚合酶鍊反應和重組酶聚合酶擴增）、熒光原位雜交、酶聯免疫法等。其中，組織分離法培養成本低、過程簡單，且可以實作活菌的定量檢測，但是檢測時間長、準确度低；顯微鏡分析法需要複雜的裝置和專業的技術人員，費用高且耗時長；免疫學檢測主要研究抗原與抗體的特異性反應，操作簡單、反應速度快；分子雜交和PCR擴增的檢測特異性強、靈敏度高，可在病害未顯現症狀或症狀不明顯時作出準确診斷，反映病害發生的嚴重程度；但是草莓植株早期感染惡疫黴分布不均勻、含量較低，導緻分析樣本量大，無法及時且準确地診斷。
Jellen等和Eikemo研究草莓植株感染惡疫黴後有機揮發性氣體随時間的變化，發現感染惡疫黴的草莓植株會散發出獨特的有機揮發性氣體4-乙基苯酚（20 ℃蒸汽壓0.13 mmHg）和4-乙基-2-甲氧基苯酚4-乙基愈創木酚（25℃蒸汽壓0.017 mmHg），而且有機揮發性氣體濃度與感染惡疫黴的嚴重程度成正比，濃度變化範圍分别為1.12~22.56 mg/kg和0.14~1.05 mg/kg。由于有機揮發性氣體4-乙基苯酚濃度遠高于4-乙基愈創木酚濃度，是以可以選擇4-乙基苯酚作為草莓惡疫黴感染的特征性氣體。
半導體場效應氣體傳感器具有成本低、功耗低、體積小、靈敏度高、易于內建等優點，可以有效克服氣相色譜-質譜、高效液相色譜等分析方法的不足，非常适合用于農業環境中有機揮發性氣體的實時監測。氣體敏感材料是半導體場效應氣體傳感器的核心，直接影響其檢測4-乙基苯酚的性能。半導體單壁碳納米管（Semiconducting Single-Walled Carbon Nanotube，SWNT）可看作是由單層石墨烯按照一定的方向卷曲而成，直徑為幾納米、長度為1~100 μm量級的一維中空管狀結構，具有高表面吸附能力、良好的導電性和電子傳輸特性，是一種優異的氣體敏感材料。但是，SWNT制備的半導體場效應氣體傳感器選擇性差且靈敏度低，無法實作對4-乙基苯酚的特異檢測。
卟啉是由四個吡咯環通過亞甲基連接配接在一起形成的大分子雜環化合物，每個吡咯環由4個碳和1個氮組成，位于大環内部的所有氮原子形成一個中心空腔，可以與幾乎所有的金屬離子配位形成金屬卟啉絡合物（Metalloporphyrin，MPs）。由于MPs的配位金屬離子處于不飽和狀态，使得氣體分子可以在MPs軸向位置通過範德華力、氫鍵與中心金屬離子互相作用，改變其自身光學或電學性能。是以，MPs可以改變卟啉分子中心金屬離子的種類、環狀結構以及周圍取代基類型來調控氣體響應的靈敏度和選擇性，實作對特定氣體的檢測。
為實作草莓疫黴果腐病早期快速診斷，本研究将SWNT沉積在場效應管，進而在SWNT表面修飾金屬卟啉提升場效應管制備氣體傳感器的靈敏度和特異性。依據不同金屬卟啉對4-乙基苯酚敏感差異，篩選出檢測靈敏度高的半導體場效應氣體傳感器。在此基礎上，進一步研究了半導體場效應氣體傳感器的最優檢測參數，提升在草莓疫黴果腐病早期診斷的實用性。
2
材料和方法
2.1 試劑與材料
半導體性單壁碳納米管（SWNT，0.01mg/mL，95%）購自美國NanoIntegris公司；丙酮、異丙醇、氫氧化鈉、氨水購自Fisher Scientific公司（中國）；3-氨丙基三乙氧基矽烷（3-aminopropyltriethoxysilane：APTES，99％）購自美國Acros Organics公司；4-乙基苯酚購自上海麥克林公司（中國）；二甲基甲酰胺（Dimethylformamide，DMF）采購自北京化工有限公司（中國）；金屬卟啉（tetraphenyl porphyrin （TPP）， iron porphyrin （FeTPP）， zinc porphyrin （ZnTPP）， copper octamethyl porphyrin （CuOEP）and manganese OEP （MnOEP））均由西格瑪奧德裡奇貿易有限公司（美國）和百靈威科技有限公司（美國）提供。
2.2 試驗儀器
拉曼光譜利用物質分子對入射光所産生的頻率發生較大變化的散射現象，檢測和識别分子的震動（聲子）狀态，實驗使用532 nm雷射激發，通過Nicolet Almega XR色散顯微鏡測量；紫外-可見光光度法使用180~780 nm的單色光輻射的吸收或反射強度來進行物質的定量、定性或結構分析，實驗使用Beckman DU800紫外/可見分光光度計（Beckman Coulter公司，美國）采集；掃描電鏡圖像由Zeiss Leo SUPRA 55獲得，光束能量為10 kV；電化學性能測定，包括電流-電壓（I-V）和電流-時間（I-T），由半導體參數分析儀（Keithley 2636）進行分析；高精密天平BSA224S電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；氯苯類富集柱采樣管采購自譜标實驗器材科技有限公司（中國）；Direct-Q8超純水機（美國Millipore公司）；實驗室管式電熱爐YG-1206（上海煜志機電裝置有限公司）。
2.3 氣體傳感器制備
間隙場效應管制作參考文獻：将表面覆寫100 nm SiO2的矽晶片分别置于丙酮、異丙醇和乙醇中各超清洗20 min，祛除表面有機污染物，氮氣吹去殘留試劑；矽晶片表面旋塗正性光刻膠，後通過曝光、顯影将間隙電極圖形印制在光刻膠表面；采用電子束蒸發鍍膜機在光刻後的基底表面依次蒸鍍20 nm鉻膜和180 nm金膜，并置于300 ℃的恒溫環境中熱處理增強鉻金層間的黏附性；最後，将熱處理後的矽晶片放入丙酮溶液中浸泡12 h，溶解光刻膠，獲得源極和漏極的間隙長寬各10 μm。
間隙場效應氣體傳感器修飾步驟如圖1所示。分别用丙酮、異丙醇和氨水清洗電極，祛除掉表面有機和無機殘留物；将場效應管源極和漏極浸入APTES中30 min，超純水洗掉表面殘留；間隙場效應管浸入單壁碳納米管溶液中60 min；使用超純水清洗場效應管表面殘留的單壁碳納米管，并置入250 ℃管式氣氛爐内，祛除單壁碳納米管表面的活性劑；将不同MPs溶解到二甲基甲酰胺（1 mg/mL），SWNT-FET浸入MPs溶液中4 h，最後在惰性氣體保護條件下，90 ℃退火60 min。
圖1 半導體場效應氣體傳感器制備示意圖
Fig.1 Schematic diagram of semiconducting field effect gas sensor
2.4 氣體發生器
圖2所示為有機揮發性氣體稀釋裝置，利用特定溫度下固體粉末4-乙基苯酚産生揮發性氣體飽和蒸汽，通過控制氣體品質控制器調節空氣流量和4-乙基苯酚有機揮發性氣體飽和蒸汽的混合比例，産生不同濃度的4-乙基苯酚蒸汽；進而在氣體管道中混合後，通過在氣體傳感器1.2 cm3的密封玻璃罩。使用Keithley 2636作為資料采集裝置，通過三個電極線（栅極、源極和漏極）與半導體場效應氣體傳感器相連接配接，源極和漏極施加可施加電壓範圍-0.1~ +0.1 V，栅極施加電壓0 V，記錄電流信号随着有機揮發性氣體濃度變化。
圖2 有機揮發性氣體稀釋裝置
Fig. 2 Organic volatile gas dilution device
2.5 信号分析
由于不同的MOEP-SWNT/FET初始電阻存在差異，影響檢測精度，為此本研究采用相對電阻（Relative resistance）變化作為響應信号，如公式（1）和（2）所示。
其中，R0為MnOEP-SWNT/FET放置在幹燥空氣中的原始電阻，Ω；R為MnOEP-SWNT/FET暴露在VOCs的電阻值，Ω；為源極和漏極間的電壓，V；為源極和漏極之間的電流，A。
半導體材料載流子遷移率µ的計算如公式（3）所示。
其中，和表示場效應管源極和漏極間的長和寬，m；為轉移電導（IDS /VG的斜率），A/V；VG為基極電壓，V；為栅極電容，nF/cm2，此處取11.6 nF/cm2。
3
結果與讨論
3.1 MnOEP-SWNT表征
利用拉曼光譜研究MnOEP修飾SWNT/FET前後變化，結果如圖3（a）所示。半導體單壁碳納米管的拉曼光譜在1351 cm-1（D Band）、1579 cm-1（G Band）、1600 cm-1（G+ Band）和2680 cm-1（2D Band）處顯示出四個峰。MnOEP修飾半導體單壁碳納米管後，G帶峰變窄，G帶位移至1598 cm-1，以及D/G強度比增加，表明MnOEP與SWNT通過非共價鍵結合，SWNT表面部分sp2轉化為sp3。
圖3 Bare SWNT（黑色）和MnOEP-SWNT（紅色）的光譜特性
Fig.3 Spectral characteristics of Bare SWNT （black） and MnOEP SWNT （red）
紫外-可見分光光度計研究SWNT和MnOEP修飾到間隙場效應管表面，為克服Si/SiO2透光性差，選擇透光性好的石英玻璃替代Si/SiO2。空白的石英玻璃吸收光譜作為基準值，圖3（b）所示SWNT被固定到石英玻璃表面後，在200~800 nm範圍内的吸光度顯著增強且200~400 nm之間有明顯的吸收峰，這與SWNT的特征吸收峰相符合，表明SWNT通過APTES的共價鍵很好的固定到石英玻璃的表面；當MnOEP修飾SWNT後，MnOEP-SWNT的吸收光譜明顯高于Bare SWNT，并且在475和560 nm處有微小的吸收峰，實驗結果與文獻相符合，表明MnOEP修飾到了SWNT表面。
圖4 SWNT/FET修飾MnOEP前後電化學性能變化
Fig. 4 Changes of electrochemical properties of MnOEP modified by SWNT/FET
如圖4（a）所示電化學分析方法表征MnOEP修飾SWNT/FET的導電性能變化。SWNT/FET和MnOEP-SWNT/FET的IDS-VDS曲線呈現較好的線性關系，但MnOEP-SWNT/FET導電性顯著降低，表明MnOEP與SWNT間互相作用發生電子轉移并形成π-π鍵。圖4（b）可知SWNT/FET的栅極門檻值電壓（VTH）為0.45 V，MnOEP修飾SWNT/FET後，FET曲線向負方向移動，VTH值為-5.3 V。根據遷移率計算方程，可知SWNT/FET和MnOEP-SWNT/FET的遷移率分别為525和387 cm2/Vs。MnOEP-SWNT/FET導電性變差的原因［26］：MnOEP和SWNT之間發生電子/電荷轉移，p型半導體SWNT/FET的空穴被MnOEP提供的電子占據，導緻MnOEP-SWNT/FET的載流子濃度低、遷移率低。
3.2 參數優化
圖5顯示了不同金屬卟啉制備的半導體場效應氣體傳感器對不同濃度4-乙基苯酚的飽和蒸汽的相對電阻。SWNT/FET對1%、10%和100% 4-乙基苯酚飽和蒸汽的相對電阻分别為0.1、0.24和0.49。當SWNT/FET修飾不同MPs後，半導體場效應氣體傳感器靈敏度變化為MnOEP-SWNT/FET > ZnTPP-SWNT/FET > CuOEP-SWNT/FET > TPP-SWNT/FET > FeTPP-SWNT/FET，表明MnOEP特殊的化學結構對4-乙基苯酚具有較高的選擇性。是以，MnOEP被選擇為半導體場效應氣體傳感器的氣敏材料。
圖5 不同MPs-SWNT/FET檢測4-乙基苯酚飽和蒸氣性能對比
Fig.5 Performance comparison of different MPs SWNT/FET for detecting saturated vapor of 4-Ethylphenol
圖6顯示了MnOEP-SWNT/FET的相對電阻變化與濃度和時間的關系。由圖可知，MnOEP-SWNT/FET檢測1%、10%和100%的4-乙基苯酚飽和蒸汽，在低濃度條件下，MnOEP-SWNT/FET的相對電阻與檢測時間呈正相關，且在5 min時達到最大值；在高濃度條件下，MnOEP-SWNT/FET的相對電阻達在2 min達到最大值，之後保持恒定值。是以，選擇5 min作為半導體場效應氣體傳感器的檢測時間。
圖6 MnOEO-SWNT/FET暴露在不同濃度的4-乙基苯酚飽和蒸氣中相對電阻與時間的變化
Fig. 6 Changes of relative resistance and time of MnOEO-SWNT/FET exposed to saturated vapor of 4-Ethylphenol at different concentrations
圖7 SWNT/FET和MnOEP-SWNT/FET的電壓-電阻變化（VG=0 V）
Fig.7 Voltage resistance change of SWNT/FET and MnOEP-SWNT/FET （VG=0 V）
源極和漏極之間電壓（VDS）是半導體場效應氣體傳感器的重要參數之一。圖4（a）中IDS-VDS采用歐姆定律計算不同電壓下的電阻，如圖7所示。在0 V的不連續性主要是由于信号采集裝置的精度不足，無法高精度采集超微電流信号；在其它電壓下，SWNT/FET和MnOEO-SWNT/FET的電阻值沒有變化，表明電壓變化對電阻無影響。是以，任何電壓可作為VDS，本研究選用0.1 V。
3.3 4-乙基苯酚檢測線性關系
為研究氣體傳感器的線性檢測範圍和最低檢測限，在最優化檢測條件下，SWNT/FET和MnOEO-SWNT/FET分别檢測不同濃度的4-乙基苯酚飽和蒸氣5 min，不同濃度間隔使用幹燥空氣清洗10 min。圖8（a）顯示了SWNT/FET和MnOEO-SWNT/FET在VDS=0.1 V和VG =0 V時，依次對氣體發生器産生的0.25%~100%的4-乙基苯酚飽和蒸氣的相對阻抗變化，可知MnOEO-SWNT/FET相對阻抗随着4-乙基苯酚飽和蒸氣濃度增大而增大。從圖8（b）的線性圖可以看出，MnOEO-SWNT/FET的相對電阻在4-乙基苯酚飽和蒸氣在0.25%~20%的濃度範圍内變化較快，而在20%~100%的高濃度範圍内增長緩慢，但都呈現出良好的線性關系，線性回歸方程分别為：
線性回歸相關系數分别為0.9411、0.9745，檢出限為0.15%的4-乙基苯酚飽和蒸氣（S/N =3）。
圖8 場效應氣體傳感器對不同濃度4-乙基苯酚飽和蒸氣的響應變化
Fig. 8 Response of field effect gas sensor to saturated vapor of 4-ethylphenol with different concentrations
3.4 一緻性
為研究傳感器的一緻性，采用上述方法制備了4個MnOEP-SWNT/FET，用于檢測不同濃度的4-乙基苯酚飽和蒸氣，如圖9所示。對比不同MnOEP-SWNT/FET檢測相同濃度的4-乙基苯酚後的相對電阻變化，相對電阻與4-乙基酚濃度呈正相關且變化趨勢一緻，各濃度下的相對标準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）均低于10%，表明MnOEP-SWNT/FET具有良好的一緻性。
圖9 不同MnOEO-SWNT/FET檢測4-乙基苯酚飽和蒸氣後相對電阻變化
Fig. 9 Change of relative resistance after detecting saturated vapor of 4-ethylphenol with different MnOEO-SWNT/FET
3.5 實際樣本分析
為驗證MnOEO-SWNT/FET分析實際樣本中4-乙基苯酚的濃度效果，實驗選用氯苯類富集柱采樣管分别富集健康草莓植株（1和2）和惡疫黴感染草莓植株（3和4）的揮發的有機揮發性氣體。采集的有機揮發性氣體使用MnOEO-SWNT/FET進行分析，進而與4-乙基苯酚飽和蒸汽等體積1:1混合，分析結果如表1所示。經過分析可知，MnOEO-SWNT/FET檢測草莓健康有較小的信号，存在假陽性，主要由于半導體氣體傳感器易受到環境幹擾；對草莓感染植株，MnOEO-SWNT/FET檢測信号較為明顯大于10% 4-乙基苯酚飽和蒸汽濃度，使用MnOEO-SWNT/FET診斷具有較高準确率。
表1 MnOEO-SWNT/FET檢測草莓健康植株和感染植株
Table 1 Detection of healthy and infected strawberry plants by MnOEO-SWNT/FET
4
結 論
有機揮發性氣體4-乙基苯酚是診斷草莓惡疫黴感染的氣體标志物，其濃度與草莓植株感染惡疫黴嚴重程度直接相關。采用半導體場效應氣體傳感器檢測4-乙基苯酚，可以有效克服傳統組織分離法、顯微鏡分析法、PCR擴增技術、熒光原位雜交、酶聯免疫法等診斷的不足，具有操作簡單、使用友善、分析低成本等優點。
本研究利用金屬卟啉的配位金屬離子處于不飽和狀态，使得氣體分子可以在MPs軸向位置通過範德華力、氫鍵與中心金屬離子互相作用，改變半導體單壁碳納米管的靈敏度和選擇性，篩選出對4-乙基苯酚靈敏度高且選擇性好的金屬卟啉MnOEP，并且與SWNT和FET聯用制備半導體場效應氣體傳感器。經過分析可知，MnOEO-SWNT/FET對有機揮發性氣體4-乙基苯酚具有較高的選擇性、靈敏性及響應時間，能夠實作對草莓植株感染惡疫黴準确的診斷，但是對于健康草莓植株診斷存在假陽性。
針對本研究MnOEO-SWNT/FET易受待測環境中溫度、有機揮發性氣體的幹擾，是以需要探究可變溫度和多氣體耦合對MnOEO-SWNT/FET的響應信号幹擾規律，提出解耦合幹擾方法，提高MnOEO-SWNT/FET在複雜環境中檢測4-乙基苯酚的精度。
智慧農業微信交流服務群
為友善農業科學領域讀者、作者和審稿專家學術交流，促進智慧農業發展，為更好地服務廣大讀者、作者和審稿人，編輯部建立了微信交流服務群，有關專業領域内的問題讨論、投稿相關的問題均可在群裡咨詢。入群方法：加小編微信331760296，備注：姓名、機關、研究方向，小編拉您進群，機構營銷廣告人員勿擾。
釋出征集
歡迎在我公衆号釋出科研團隊介紹、創新科研成果及相關活動等資訊。