引言
細胞内鈣離子（Ca2+）信号在生物學中普遍存在，是細胞信号傳導的關鍵元素。現有的熒光傳感器和報告基因雖然可以檢測到Ca2+濃度升高的激活細胞，但這些方法需要通過植入物向深層組織傳遞光信号，無法在自由活動的動物中非侵入性地使用。8月5日Nature Methods的研究報道“Rapid, biochemical tagging of cellular activity history in vivo”，介紹了一種新型酶催化方法，通過在體内快速生化标記Ca2+濃度升高的細胞。該方法利用Ca2+激活的split-TurboID（CaST）酶，在外源生物素（biotin）分子的輔助下，在10分鐘内标記激活的細胞。酶促信号随着Ca2+濃度和生物素标記時間的增加而增強，表明CaST可以作為總Ca2+活動的時間門控整合器。此外，與需要數小時才能産生信号的轉錄報告基因不同，CaST的讀出可以在活動标記後立即進行。細胞内離子濃度的動态變化使細胞能夠響應和适應其局部環境，最終有助于機體的正常生理功能。例如，神經元作為大腦的基本功能單元，可以被各種外部刺激或藥理化合物激活，導緻細胞内Ca2+濃度的快速波動。是以，通過細胞内Ca2+水準的變化可以直接衡量複雜神經網絡的活動。遺傳編碼的Ca2+訓示劑已經極大地改變了我們在清醒和活動的動物中記錄神經活動的能力。然而，熒光傳感器的一個主要限制是其讀出信号是瞬時的，并且通常需要侵入性的方法才能獲得深層腦結構的光學信号。這使得将給定神經元的活動曆史與其衆多其他細胞特性（例如精确的空間定位、RNA表達或蛋白質表達）相結合變得具有挑戰性。為克服這一問題，先前的研究設計了正交轉錄報告基因（如FLARE、FLiCRE、Cal-Light）或熒光蛋白（如CaMPARI）以穩定标記在高細胞内Ca2+水準下激活的細胞。然而，這些方法都依賴光敏蛋白質，需要藍光或紫外光來限制細胞活動标記的時間視窗。這一要求限制了其在深層腦區或無法植入光纖的體區的可擴充性。另一個穩定标記的方法包括基于即刻早期基因（IEG）的轉錄報告基因（如TRAP2和tetTag），這些方法利用藥物注射而非光照來控制活動标記視窗。然而，雖然IEG活動已被證明與多種細胞類型的神經活動相關，但它遠不如Ca2+作為通用的讀出信号。此外，IEG表達的緩慢起效限制了在特定時間視窗内立即标記和識别激活的神經元的能力。在該研究中，研究人員設計了一種依賴于Ca2+的酶，通過将外源生物素分子連接配接到激活的細胞上，來報告活細胞内Ca2+水準的升高。重新設計并重新利用了一種近距離标記酶split-TurboID，以在活細胞内通過外源生物素分子标記蛋白質來報告細胞内Ca2+水準的升高。這種方法在不需要光照的情況下，能夠在幾分鐘内标記細胞，為神經活動記錄提供了一種快速、非侵入性的新政策。
細胞内鈣離子（Ca2+）作為一種重要的信号分子，幾乎參與了所有的細胞信号傳導過程。在神經元中，Ca2+濃度的變化與神經活動密切相關，是研究神經網絡活動的重要名額。目前，利用熒光傳感器和報告基因可以檢測Ca2+濃度升高的激活細胞，但這些方法往往需要侵入性操作，例如植入物來向深層組織傳遞光信号，這使得在自由活動的動物中進行非侵入性檢測變得困難。為了克服這些限制，研究人員設計了一種基于酶催化的生化标記技術，能夠快速标記Ca2+濃度升高的細胞。這項技術被稱為Ca2+激活的split-TurboID（CaST），通過外源生物素（biotin）分子的輔助，在10分鐘内完成标記。這種方法不僅快速，而且能夠在不使用光照的情況下實作細胞标記，進而大大提高了其在深層腦區和其他體内組織中的應用潛力。
研究團隊首先設計了一種依賴Ca2+的酶，這種酶能夠在Ca2+濃度升高時重組并激活，進而标記目标細胞。具體來說，CaST由兩部分組成：一部分是與Ca2+結合的鈣調蛋白（calmodulin，CaM），另一部分是合成肽M13。這兩部分分别連接配接到split-TurboID的兩個不活躍片段上（sTb(N)和sTb(C)）。當細胞内Ca2+濃度升高時，CaM部分會被招募到M13，進而使split-TurboID重新組裝并激活。在外源生物素存在的情況下，重組後的split-TurboID會标記自身及周圍的蛋白質。
研究人員在HEK293T細胞中表達了不同版本的CaST工具，通過生物素和Ca2+處理細胞，并用Alexa Fluor 647（SA-647）結合的鍊黴親和素（streptavidin）染色來檢測生物素标記的蛋白質。結果顯示，在外源生物素存在下，CaST能夠在Ca2+濃度升高時有效地标記目标蛋白質。為了驗證CaST的有效性，研究團隊進行了多種實驗。他們将CaST的兩個片段分别連接配接到不同的蛋白質上，并通過不同的組合方式表達在HEK293T細胞中。通過生物素和Ca2+的共同處理，研究人員發現其中一種組合（膜結合的CD4-sTb(C)-M13-GFP與胞質中的CaM-V5-sTb(N)）表現出最高的信号背景比（signal-to-background ratio, SBR）。他們進一步優化了轉染比例，發現5:2的轉染比例（CD4-sTb(C)-M13-GFP(N)）能夠獲得最佳的标記效果。
通過熒光顯微鏡和western blot，研究人員驗證了CaST在不同Ca2+濃度和刺激時間下的标記效果。結果顯示，CaST的标記信号随着Ca2+濃度的增加和刺激時間的延長而增強，表明其具有良好的時間和濃度依賴性。具體實驗中，研究人員在HEK293T細胞中表達CaST，并通過生物素和Ca2+共同處理細胞。通過熒光顯微鏡觀察到，在生物素和Ca2+共同存在時，細胞内的生物素标記信号顯著增強，而在僅有生物素或Ca2+單獨存在時，标記信号較弱或不存在。
CaST的功能和有效性驗證（Credit: Nature Methods）
蛋白質結構預測：使用AlphaFold2預測了CaST的兩個半部分蛋白質結構。圖示展示了兩部分在單獨狀态下（預期無Ca2+存在時）和複合狀态下（預期高Ca2+存在時）的結構。兩部分蛋白質在Ca2+依賴下可逆地重新組裝。預測的生物素結合位點以藍色顯示。CaST設計：CaST在HEK細胞中的表達設計示意圖。包含sTb(C)-M13-GFP的部分通過CD4細胞膜蛋白的跨膜域錨定在膜上，而CaM-V5标簽-sTb(N)部分則在胞質中表達。隻有在細胞接受生物素處理并表現出升高的細胞内Ca2+時，CaST才會标記蛋白質。熒光圖像：HEK細胞的共聚焦圖像，這些細胞同時轉染了CaST的兩個部分，并在±Ca2+的條件下處理30分鐘生物素。細胞被洗滌、固定，并用抗V5和SA-647染色。抗V5信号标記了CaM-sTb(N)部分，而GFP熒光顯示了CD4-sTb(C)-M13部分。蛋白質的生物素化通過SA-647染色檢測。Western blot分析：HEK細胞被轉染CaST并在±50 µM生物素和±Ca2+（5 mM CaCl2和1 µM ionomycin）條件下處理30分鐘。細胞随後用Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液（DPBS）洗滌，收集全細胞裂解液，并使用鍊黴親和素-辣根過氧化物酶（SA-HRP）或抗V5/HRP進行Western blot分析。‘N’表示預期的CaM-V5-sTb(N)片段大小，而‘C’表示預期的CD4-sTb(C)-M13-GFP片段大小。生物素化蛋白質的定量：量化了Western blot實驗中的生物素化蛋白質。兩次獨立的生物重複進行了量化，整個條帶下方的75-kDa内源性生物素化條帶被納入量化（總原始強度像素值的總和）。
為了測試CaST的穩定性，研究人員将HEK細胞處理30分鐘的Ca2+後洗滌10分鐘，再加入生物素進行30分鐘的标記。結果顯示，洗滌後的細胞沒有出現顯著的标記信号，表明CaST的重組和激活是可逆的。此外，通過增加Ca2+濃度進行滴定實驗，結果顯示CaST的标記信号與Ca2+濃度呈線性相關，進一步驗證了其高靈敏度和特異性。
研究表明，CaST能夠在體外和體内高效地标記Ca2+濃度升高的細胞。在HEK細胞實驗中，CaST在生物素和Ca2+共同存在時表現出顯著的标記信号，而在僅有生物素或Ca2+單獨存在時，标記信号較弱或不存在。這表明CaST能夠作為一種Ca2+依賴的标記工具，有效區分不同條件下的細胞活動。在進一步的實驗中，研究人員通過熒光顯微鏡和西方印迹法驗證了CaST在不同Ca2+濃度和刺激時間下的标記效果。結果顯示，CaST的标記信号随着Ca2+濃度的增加和刺激時間的延長而增強，表明其具有良好的時間和濃度依賴性。
CaST的性能（Credit: Nature Methods）
HEK細胞的熒光顯微鏡圖像：圖像展示了轉染CaST的HEK細胞在50 µM生物素和±Ca2+（5 mM CaCl2和1 µM ionomycin）條件下處理30分鐘的情況。頂部顯示SA-647染色的生物素化蛋白質，底部顯示CD4-sTb(C)-M13-GFP。單細胞分析：單細胞分析結果顯示了不同GFP表達水準下細胞的SA-647标記與GFP熒光強度的散點圖。結果表明，在加生物素和Ca2+條件下，SA-647染色顯著增加，而僅有生物素時則沒有顯著增加。SA-647/GFP熒光比率的分布：小提琴圖展示了不同處理條件下單細胞SA-647/GFP熒光比率的分布。加生物素和Ca2+的條件下，SA-647/GFP比率顯著高于其他條件。CaST-IRES建構設計示意圖：展示了雙順反子CaST-IRES建構的設計，用于在HEK細胞中同時表達CaST的兩個部分。CaST-IRES的熒光圖像：展示了轉染CaST-IRES的HEK細胞在50 µM生物素和±Ca2+條件下處理30分鐘的情況。與之前類似，頂部顯示SA-647染色的生物素化蛋白質，底部顯示CD4-sTb(C)-M13-GFP。單細胞分析（CaST-IRES）：散點圖顯示了不同處理條件下，GFP陽性細胞的平均SA-647與平均GFP熒光強度的關系。結果表明，在加生物素和Ca2+條件下，SA-647染色顯著增加，而僅有生物素時則沒有顯著增加。SA-647/GFP熒光比率的分布（CaST-IRES）：小提琴圖展示了不同處理條件下單細胞SA-647/GFP熒光比率的分布。加生物素和Ca2+的條件下，SA-647/GFP比率顯著高于其他條件。CaST非IRES與IRES版本的比較：圖表展示了CaST非IRES和IRES版本在不同條件下的SA-647/GFP熒光比率的分布。IRES版本的CaST在加生物素和Ca2+條件下的标記效果顯著優于非IRES版本。ROC曲線分析：ROC曲線分析顯示了CaST非IRES和IRES版本區分Ca2+處理和非處理細胞群體的能力。非IRES版本的AUC為0.87，而IRES版本的AUC為0.93，表明IRES版本在區分活化與未活化細胞方面具有更高的精确度。
神經元實驗研究人員将CaST應用于培養的神經元中，驗證其在神經細胞中的有效性。他們使用腺相關病毒（AAV）在大鼠海馬神經元中表達CaST，并通過鉀離子（KCl）刺激神經元，觀察Ca2+濃度變化和CaST标記情況。結果顯示，CaST能夠在KCl刺激後的10分鐘内有效标記Ca2+濃度升高的神經元。此外，研究人員還利用CaST檢測了不同藥理學試劑對神經元Ca2+濃度的影響。例如，多巴胺（dopamine，DA）和2,5-二甲氧基-4-碘苯丙胺（DOI）對神經元Ca2+濃度的調節效果。結果表明，DOI能夠顯著提高神經元内Ca2+濃度并引起CaST标記，而DA則未能顯著影響Ca2+濃度。
CaST在培養的神經元中的性能（Credit: Nature Methods）
神經元中CaST的表達和标記：a部分展示了培養的大鼠海馬神經元中表達CaST的熒光顯微鏡圖像。這些神經元被腺相關病毒（AAV）感染，表達CD4-sTb(C)-M13-GFP和CaM-sTb(N)兩個部分，并在±生物素和±KCl條件下處理30分鐘。圖像顯示了生物素化蛋白質的SA-647染色，GFP熒光标記了CD4-sTb(C)-M13。不同處理條件下的SA-647/GFP比率：b部分量化了圖a中不同處理條件下的SA-647/GFP熒光比率。結果顯示，+生物素 +KCl條件下的比率顯著高于其他條件。10分鐘KCl刺激後的CaST标記：c部分展示了神經元在10分鐘±生物素和±KCl條件下處理後的熒光顯微鏡圖像。結果顯示，在生物素和KCl共同處理下，SA-647标記顯著增強。10分鐘标記的SA-647/GFP比率：d部分量化了圖c中不同處理條件下的SA-647/GFP熒光比率。結果表明，在10分鐘的KCl和生物素共同處理下，SA-647/GFP比率顯著增加。GFP+神經元中的SA-647标記比例：e部分量化了10分鐘和30分鐘标記實驗中，GFP+神經元中SA-647+細胞的比例。結果顯示，在生物素和KCl共同處理下，10分鐘标記的SA-647+細胞約占GFP+神經元的35%，而30分鐘标記的則約占65%。而在僅有生物素處理下，SA-647+細胞比例較低（約10%）。不同藥物處理後的CaST标記：f部分展示了大鼠海馬神經元在50 µM生物素和10 µM DA、10 µM DOI或30 mM KCl條件下處理30分鐘後的熒光顯微鏡圖像。結果表明，DOI和KCl處理顯著增加了SA-647标記，而DA處理未顯著影響SA-647标記。不同藥物處理條件下的SA-647/GFP比率：g部分量化了圖f中不同藥物處理條件下的SA-647/GFP熒光比率。結果顯示，KCl和DOI處理顯著增加了SA-647/GFP比率，而DA處理未顯著影響該比率。
動物實驗研究人員進一步在小鼠模型中驗證了CaST的應用。他們在小鼠前額葉皮層（prefrontal cortex，PFC）中表達CaST，并通過迷幻藥物（如psilocybin）誘導神經元活動。通過測量小鼠的頭部擺動反應（head-twitch response，HTR），研究人員發現，psilocybin能夠顯著增加PFC神經元的Ca2+濃度，并引起CaST标記。這一結果表明，CaST能夠在自由活動的小鼠中，非侵入性地标記和檢測神經活動。
CaST在小鼠體内非侵入性标記和檢測psilocybin激活的神經元的能力（Credit: Nature Methods）
實驗示意圖：a部分展示了使用CaST标記psilocybin激活的神經元的實驗流程。小鼠注射CaST病毒後，在自由活動狀态下進行psilocybin處理，并通過生物素标記激活的神經元。随後進行SA-647染色和頭部擺動反應（HTR）的測量。mPFC區域的SA-647和GFP熒光圖像：b部分展示了前額葉皮層（mPFC）區域的熒光顯微鏡圖像，對比了注射生物素+生理鹽水和生物素+psilocybin的小鼠。結果顯示，psilocybin處理的小鼠mPFC區域的SA-647标記顯著增加。單個神經元的SA-647與GFP熒光強度：c部分量化了b部分中每個GFP+神經元的SA-647與GFP熒光強度。水準虛線表示生物素+生理鹽水組中所有SA-647神經元的第90百分位門檻值。FOV的SA-647/GFP比率：d部分量化了c部分中不同視野（FOV）的SA-647/GFP熒光比率。結果顯示，psilocybin處理的小鼠比率顯著高于生理鹽水處理的小鼠。SA-647+神經元的比例：e部分展示了所有GFP+神經元中SA-647+神經元的比例。結果表明，psilocybin處理組中大約70%的GFP+神經元表現出強SA-647标記，而生理鹽水處理組中這一比例較低。SA-647+神經元與HTR的相關性：f部分展示了SA-647+ mPFC神經元在HTR測量期間的細胞掩膜。具有相同數量HTR的視野來自相同的小鼠，但來自對側半球的獨立CaST注射。HTR數量與SA-647+神經元數量的關系：g部分量化了f部分資料中每平方毫米SA-647+神經元數量與HTR數量的關系。結果表明，SA-647+神經元數量與HTR數量呈正相關。HTR數量與SA-647/GFP比率的關系：h部分量化了f部分資料中所有神經元的平均SA-647/GFP比率與HTR數量的關系。結果顯示，psilocybin處理組中具有HTR的小鼠的SA-647/GFP比率顯著增加。與c-Fos的對比：i部分展示了psilocybin處理後mPFC區域的CaST GFP、SA-647和c-Fos染色圖像。結果顯示，psilocybin處理顯著增加了SA-647标記，但對c-Fos标記影響較小。c-Fos+神經元數量：j部分量化了每平方毫米c-Fos+神經元數量。結果顯示，psilocybin處理未顯著增加mPFC區域的c-Fos标記。SA-647+神經元數量：k部分量化了每平方毫米SA-647+神經元數量。結果顯示，psilocybin處理顯著增加了mPFC區域的SA-647标記。SA-647+/GFP+神經元比例：l部分展示了每平方毫米FOV中SA-647+神經元占GFP+神經元的比例。結果表明，psilocybin處理顯著增加了該比例。
CaST技術的出現為細胞活動的非侵入性标記提供了一種新的工具。相比于傳統的熒光傳感器和轉錄報告基因，CaST具有标記速度快、非侵入性和高效的特點。這使得它在深層腦區和其他難以光學通路的體内組織中具有廣泛的應用前景。未來，CaST有望被用于研究神經網絡活動與行為之間的關系。例如，在研究迷幻藥物對神經活動的影響時，CaST可以用來标記和分析藥物作用下的神經元活動。此外，CaST還可以與其他空間分子成像技術結合，揭示特定時間窗内激活的神經元的基因表達和蛋白質分布情況，進而為神經科學研究提供更全面的視角。
總之，CaST作為一種快速、非侵入性和高效的細胞活動标記工具，具有廣闊的應用前景和重要的研究價值。通過進一步優化和擴充其應用範圍，CaST有望在神經科學和其他生物醫學領域産生深遠的影響。
參考文獻
Zhang R, Anguiano M, Aarrestad IK, Lin S, Chandra J, Vadde SS, Olson DE, Kim CK. Rapid, biochemical tagging of cellular activity history in vivo. Nat Methods. 2024 Aug 5. doi: 10.1038/s41592-024-02375-7. Epub ahead of print. PMID: 39103446.https://www.nature.com/articles/s41592-024-02375-7
責編|探索君
排版|探索君
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