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ChemBioChem. |蔗糖合酶糖基化級聯法制備黃酮類化合物的産物及反應條件研究

今日推送的文章是ChemBioChem發表在上的“Determinants of Product Outcome in Two Sesquiterpene Synthases from the Thermotolerant Bacterium Rubrobacter radiotolerans”,作者為曼徹斯特生物技術研究所的Joshua N. Whitehead。

耐輻射紅杆菌橙花叔醇合酶 (NerS) 和反式-α-香檸檬烯合酶 (BerS) 是從耐熱細菌中發現的第一批萜烯合酶 (TPS) 之一,盡管它們共用相同的底物,但會使用不同的碳支架生成萜類化合物。本文研究了 NerS 和 BerS 的潛在熱穩定性,發現 NerS 在高達 55 °C 的溫度下仍能保持活性。設計了一個包含 22 個 NerS 和 BerS 變體的庫,以探究 NerS 和 BerS 的不同反應機制,包括可能參與底物螯合、反應中間體的陽離子-π 穩定和活性位點輪廓塑造的殘基。

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NerS 和 BerS 的生物資訊學分析和同源性模組化

NerS 和 BerS 具有典型的 I 類 TPS 金屬結合基序。在 NerS 中,這些基序為 82DDxxD 和 223NxxxSxxxE,在 BerS 中,這些基序為 89DDxxD 和 243NxxxSxxxE。結合的三核金屬簇(通常是鎂或錳)有助于隔離底物,是以對 TPS 活性至關重要。結構保守的細菌效應基序 177RxxTG 和 197RxxTG 也分别存在于 NerS 和 BerS 中,其中精氨酸“傳感器”是保守的,蘇氨酸和甘氨酸代表細菌 TPS 中最常見的“連接配接子”和“效應子”殘基。精氨酸感覺底物的焦磷酸 (PPi) 部分,效應物通過将電子密度捐贈給底物的 C2=C3 雙鍵的 π* 分子軌道來啟動反應級聯,進而觸發電離并形成後續陽離子中間體。1NerS 和 BerS 在 SwissProt 資料庫中查詢時與細菌和真菌 TPS 最為相似。它們的主要産物是否來自法呢基或橙花基陽離子也與此資料庫中的最佳比對一緻。這與植物 TPS 形成鮮明對比,植物 TPS 通常傾向于根據系統發育進行聚類。

使用 SWISS-MODEL 的 Automodel 函數 18 基于 PDB:4OKM(焦磷酸鹽複合物中的 selinadiene 合酶)模闆建構了 NerS 和 BerS 的同源性模型(NerS-HM 和 BerS-HM)。模闆 4OKM 與 NerS 和 BerS 的序列同一性分别為 32.69% 和 23.96%。這些是不相關 TPS 的典型值,如 SwissProt 資料庫中的最佳比對所示,盡管 NerS 與特征化 TPS 具有更高的序列同源性。在這兩種模型中,PDB:4OKM 中的三種鎂離子和焦磷酸鹽均未保留。在 NerS-HM 中,保留了兩種金屬離子和焦磷酸鹽;在 BerS-HM 中僅保留了一種金屬離子。在這兩種情況下,缺失的鎂離子都是通過與 4OKM 對齊添加的,進而完成已知存在于 I 類 TPS 中的三核簇。9焦磷酸配體(保留在 NerS-HM 中并導入 BerS-HM)後來用作分子對接的參考。兩種模型中缺失的金屬離子都會影響(或導緻)DDxxD 金屬結合基序的位置,其中 D86(NerS)和 D93(BerS)不适合與其中一個導入的金屬離子結合。通過将 NerSHM 和 BerS-HM 與使用 AlphaFold 建構的類似模型進行比較,可以強調這一點,其中除 NerS-D86 和 BerS-D93 外,金屬結合和效應基序的對齊良好。可能是因為鎂離子對第三個位點的親和力較弱,如文獻中的其他例子所表明的那樣 19,是以在同源性模型中很難預測。盡管如此,這兩個模型可能都很好地近似了 NerS 和 BerS 的整體結構及其關鍵基序,并且在分子動力學 (MD) 模拟過程中保持穩定。

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圖1

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分子對接

使用 Autodock Vina20 将天然 sTPS 底物 FPP 對接至 NerS-HM 和 BerS-HM(包括三種金屬離子),如方法部分所述。最佳構象異構體的選擇基于三個标準:1) FPP 的 PPi 部分與保留的或從模闆 PDB:4OKM 導入的 PPi 配體的對齊;2) PPi 部分與相對于精氨酸傳感器殘基 R177 (NerS) 和 R197 (BerS);3) FPP 的 C3 相對于效應殘基 G181 (NerS) 和 G201 (BerS) 的位置和方向。後兩個标準尤為重要,因為已知通過這種催化基序電離 FPP 會引發 I 類 TPS 中的反應級聯。8對于 NerS 和 BerS,所選的結合模式都是頂級結果之一,其中一些具有“更好”對接分數的結果可能會被丢棄,因為顯然不切實際(例如,子狀态相對于活性位點“頂部”的金屬離子翻轉)。最終模型 NerS-HM-3Mg-FPP 和 BerS-HM-3Mg-FPP 的活性位點如圖 1 所示。NerS 中的疏水口袋由非極性殘基 L55、Y75、M78、F79、V219 和 W305 定義(圖 1C)。極性殘基 N302 指向 FPP 的尾部,對應于幾個特征 TPS16、21、22 中的催化天冬酰胺殘基,盡管這些酶會産生環狀産物而 NerS 不會。Y75、F79 和 W305 有可能通過陽離子-π 互相作用影響反應。F79 是最佳候選者,因為它的芳香環與 FPP 的 C3 相鄰,距離為 4.6 Å。在電離和異構化步驟期間和之後,正電荷會在 C3 上積累,這些步驟據推測發生在橙花叔醇的形成過程中。Y75 和 W305 也具有陽離子-π 互相作用的能力,但距離 FPP 中最近的 sp2 碳(C7)較遠,據推測在非環狀橙花叔醇形成過程中不會發生雜化變化。是以,Y75 和 W305 更有可能與所描述的其他非極性殘基一起定義活性位點輪廓。在 BerS 中,活性位點由相應的殘基 L62、L85、L86、S82、F171、C239、I325 和 W328 定義(圖 1D)。F171 的芳香環距離 FPP 的 C3 5.5 Å,方向不利于陽離子-π 互相作用。BerS 缺乏與 NerS 中的 Y75 和 F79 相對應的芳香性,而是在這些位置上具有絲氨酸和亮氨酸(S82 和 L86)。它在 I325 處也缺乏極性,這對應于 NerS 中的 N302。反式-α-香檸檬烯的形成需要比橙花叔醇更大的底物重排,盡管如以下部分所示,BerS 主要是一種 (E)-β-法呢烯合酶。(E)-β-法呢烯由法呢基陽離子在電離後簡單的去質子化而産生。然而,正如後面所讨論的,許多植物 (E)-β-法呢烯合酶産生反式-α-香檸檬烯作為次要産物,BerS 也是如此。這方面的一個适應性可能是 S82,其側鍊羟基相對于 FPP 的 C7 處于有利位置,在形成紅沒藥基陽離子後,正電荷會在那裡積累。是以,該殘基可能通過陽離子偶極互相作用在反式-α-香檸檬烯的形成中發揮作用。

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NerS、BerS 及其變體的體内産品概況

根據上述确定的假定活性位點,選擇 NerS 和 BerS 中的六個類似殘基進行突變,以建立單點變體的微型文庫。這些殘基是(NerS/BerS):Y75/S82、M78/L85、F79/L86、G181/G201、V219/C239 和 N302/I325。通過交換每對殘基和/或建立更大和更小的變體來選擇變體。總共建立了 22 種單點變體酶。使用之前描述的“即插即用”平台對 WT NerS、WT BerS 和變體微型文庫進行了體内分析。之前有報道稱,在體内分析時,NerS 會産生單萜 β-月桂烯和香葉醇,以及倍半萜橙花叔醇、α- 和 β-法呢烯和法呢醇。據報道,BerS 會産生單萜 β-月桂烯、香葉醇和芳樟醇,以及倍半萜橙花叔醇、法呢醇、法呢烯(未指定異構體)和反式-α-香檸檬烯。該研究未對這些化合物的産品滴度進行量化。本研究中對 NerS 和 BerS 的體内分析證明了這些單萜和倍半萜的存在。值得注意的是,由于即插即用平台依賴于 C5 前體 IPP 和 DMAPP 的過量生産以及 GPP 合酶的過量表達,過量的香葉醇很可能是由于 GPP 轉化而産生的,而 TPS 無法足夠快地處理 GPP。這是由大腸杆菌中的内源性磷酸酶完成的,并解釋了為什麼香葉醇在大多數樣品中的滴度最高,包括稍後讨論的原本無活性的變體。相同的轉化可能解釋了體内觀察到的部分法呢醇(來自 FPP)。雖然體外測定證明法呢醇在 WT NerS、WT BerS 和 BerS-L86F 中的存在是酶促的,但僅通過體内測定無法完全區分酶促和内源性法呢醇,是以對于變體庫的其餘部分,沒有詳細考慮法呢醇産生的變化。WT NerS 和 BerS 的主要産物如圖 2 所示。

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圖2

橙花叔醇是 NerS 的主要産物,它還生産少量芳樟醇、法呢醇和 (E)-β-法呢烯。值得注意的是,NerS 生産的橙花叔醇比法呢醇多得多,并且(E)-β-法呢烯,表明 NerS 成功将 FPP 電離為法呢基陽離子,并将法呢基陽離子異構化為橙花叔醇陽離子(圖 3)。雖然橙花叔醇也可以從法呢基陽離子中獲得,但變體庫的結果表明它是由 NerS 和 BerS 中的橙花叔醇陽離子形成的。此外,由于這兩種酶都會産生法呢醇和橙花叔醇(已證明它們是酶促産物),是以每種酶中更有可能有一個專門的水攻擊/去質子化步驟,并且法呢醇和橙花叔醇分别來自非異構化或異構化陽離子的羟基化。相比之下,BerS 的主要産物是 (E)-β法呢烯和法呢醇,它們均來自法呢基陽離子。橙花叔醇和反式α-香檸檬烯源自橙花叔醇陽離子,在 BerS 中僅以極低濃度檢測到。是以,盡管 BerS 以前被指定為反式α-香檸檬烯合酶 10,但将其視為 (E)-β-法呢烯合酶似乎更合适,盡管它可以制造反式α-香檸檬烯,并且 BerS 這個名稱将保留以保持一緻性。使用純化蛋白質進行體外測定,确認了 WT NerS 和 BerS 的産物概況,并證明主要産物的産生是酶促的。所有 NerS 變體産生的橙花叔醇都比 WT 少,盡管這可能是由于可溶性表達的變化。是以,這裡的重點放在産品比例的變化或新産品的出現上,這可能是由于酶促變化造成的。

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圖3

NerS-M78F 的産物特征與 WT NerS 相似,産生的橙花叔醇比 (E)-β-法呢烯或法呢醇多,盡管總體滴度低約 10 倍。然而,盡管總體滴度較低,但檢測到的芳樟醇 (單萜類化合物) 數量與 WT 相似。這表明 M78 可能在定義活性位點的大小方面發揮作用。M78A 似乎不活躍,可能是因為松弛的活性位點口袋無法正确隔離底物(M78 也與 DDxxD 基序的 D82 形成氫鍵)。然而,M78F 的額外空間體積可能促進 GPP (C10) 的結合取代 FPP (C15),進而産生更多的單萜類化合物産品,但需要做更多的工作來證明這一點。在對接實驗中,NerS 中的 F79 被強調為具有潛在重要性,因為其芳香環相對于對接底物 C3 的位置有利(圖 1C)。在電離和異構化期間和之後,C3 上正電荷的陽離子-π 穩定将促進橙花醇在法呢基陽離子上的形成(圖 3)。F79 的這一作用得到了 NerS-F79A 資料的支援,它産生的橙花醇比 WT 少約 15 倍(圖 4)。F79L 變體中的橙花醇産量略高,但仍比 WT 低約 10 倍,這表明較大亮氨酸殘基的存在可以在一定程度上“挽救”WT 活性,但芳香性是完全活性所必需的,這與在其他萜烯合酶中觀察到的情況一緻。通過改變 NerS 的效應殘基 (G181) 産生了兩種變體。效應三聯體在細菌和真菌 TPSs17 中在結構上完全保守,其中殘基的突變通常會導緻酶失活,因為其隔離底物和啟動反應的能力受損。是以,基于細菌芳樟醇合酶 (bLinS)2 的不尋常異亮氨酸效應物,較大 G181I 變體失活,正如預期的那樣。然而,據報道,該位置存在一些可塑性。還制作了 NerS-G181A 變體,它産生的橙花叔醇是所有 NerS 變體中最多的(15.8 ± 3.1 mg L-1org vs WT 中的 22.0 ± 4.8 mg L-1org,圖 4)。這再次說明,細菌 TPS 可以容忍此位置的突變。由于反應是由效應殘基的主鍊羰基引發的,是以側鍊的身份不太重要,隻要新的殘基足夠小且足夠靈活,不會破壞 G 螺旋的整體動力學。事實上,正如之前所指出的,合理設計具有不同側鍊特性的效應殘基可以證明是建構設計 TPS 的有用工具。9V219C 和 N302I 均産生了約 1.0 mg Lorg-1 的橙花叔醇,而 N302Y 根本不産生橙花叔醇,隻産生了微量的芳樟醇。這兩種殘基都構成了活性位點的堿基(圖 1C),而大分子酪氨酸取代的存在可能會阻止較長的 FPP 底物的結合并削弱較短的 GPP 的結合。

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圖4

許多 BerS 變體能夠生成 (E)-β-法呢烯,盡管數量有所減少。兩種變體 L86F 和 S82L 産生的産物滴度高于 WT,将分别進行讨論。BerS-L85A 産生的 (E)-β-法呢烯比 WT-BerS 少約 4 倍,而 L85F 似乎沒有活性。L85 位于活性位點入口附近,這可以解釋當替換大苯丙氨酸時觀察到的産物不足。BerS-S82Y 沒有檢測到任何産物。S82 的羟基側鍊指向活性位點,可能與 C7 發生有利互相作用,其中正電荷在通向反式-α-香檸檬烯的途中在紅沒藥基陽離子中積累。突變為酪氨酸會顯着降低活性位點體積,進而排除底物,就像 L85F 一樣。值得注意的是,這些失活變體甚至沒有檢測到來自較短 GPP 底物的單萜産物,盡管這也可能是由于可溶性表達的變化。BerS 中的效應殘基是 G201,該位置的突變與 NerS 中的突變具有相同的效果。用異亮氨酸替換甘氨酸會導緻酶失活,但在 BerS-G201A 中,主要産物 (E)-β-法呢烯的檢測水準接近 WT 水準。這再次說明細菌 TPS 在這個重要的催化位置具有一定的可塑性。

底物 FPP 電離産生法呢基陽離子(圖 3)。通過在 C14 處去質子化猝滅該陽離子可産生 (E)β-法呢烯。或者,法呢基陽離子異構化通過焦磷酸橙花醇酯産生橙花醇基陽離子。從那裡,1,6 環閉合産生紅沒藥基陽離子,然後 2,7 環閉合和去質子化産生反式-α-香檸檬烯。如果 NerS 和 BerS 從橙花醇基陽離子産生橙花醇,正如我們根據上述原因假設的那樣,與 (E)-β-法呢烯和法呢醇相比,NerS 中橙花醇占主導地位對于 BerS,表明 NerS 可以更成功地進行生成橙花醇陽離子的異構化步驟。這反映在 BerS 中 (E)-β-法呢烯:反式-α-香檸檬烯的比例約為 17:1,法呢醇:橙花醇的比例約為 10:1。然而,值得注意的是,盡管 NerS 似乎更容易達到橙花醇陽離子,但它沒有正确的活性位點結構來随後獲得紅沒藥醇陽離子。體外和體内獲得的産物概況還表明,與 NerS 不同,BerS 優先通過去質子化猝滅底物,因為 (E)-β-法呢烯和反式-α-香檸檬烯是通過這種方式形成的。此外,如圖 3 所示,對于 (E)β-法呢烯和反式-α-香檸檬烯,這種去質子化發生在相同的位置 (C14)。如果假設,如文獻所示,8, 9 TPS 底物以産物樣構象結合,整體重排最少,那麼這兩種産物之間的主要差別在于去質子化步驟發生之前反應進行了多遠。也許正是出于這個原因,盡管 (E)-β-法呢烯和反式-α 香檸檬烯看起來不同,但經常被觀察為副産物。

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植物 (E)-β-法呢烯合成酶通常會

産生反式α香檸檬烯作為副産物

Durairaj 等人之前曾分析過植物倍半萜合酶 (sTPS),并組裝了一個注釋庫,以識别控制産物結果的基序。檢查該庫後發現,幾種被稱為 (E)-β-法呢烯合酶的種子植物 sTPS 也會産生反式-α-佛手柑烯作為次要産物。Köllner 及其同僚在玉米和玉米植物中探索了這種關系,已知玉米和玉米植物會釋放揮發性萜烯來抵禦鱗翅目幼蟲,進而吸引它們的天敵寄生蜂 Cotesia marginiventris。這種防禦政策中最重要的兩種化合物是 (E)-β-法呢烯和反式-α-佛手柑烯,其中一種特定的 TPS(“TPS10”)負責玉米中這些化合物的生物合成。對于 TPS10 酶的不同同源物,這兩種産物的比例各不相同,取決于單個氨基酸亮氨酸/苯丙氨酸轉換。對于産生等量兩種産物的酶,該殘基是亮氨酸。對于優先産生 (E)-β-法呢烯的兩種酶,它是苯丙氨酸。這些組之間的亮氨酸和苯丙氨酸的互相突變交換了産物分布比例,強烈表明該位置控制着 (E)-β-法呢烯和反式-α-佛手柑烯之間的分布。作者推測,苯丙氨酸的增大可能會抑制橙花烷基焦磷酸酯在通向橙花烷基陽離子的途中的形成或旋轉,進而防止異構化。為了加強這一點,當用已經異構化的非天然底物 (Z,E)-FPP 喂養酶時,它們的産物分布以反式-α-佛手柑烯為主。

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圖5

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BerS-S82L 阻止異構化

BerS-S82L 産生的主産物 (E)-β-法呢烯的滴度高于 WT BerS,并且總體産物滴度也更高。它還表現出對非異構化産物的偏好增加,其中 (E)-β-法呢烯:反式-α 香檸檬烯的比例約為 23:1,法呢醇:橙花叔醇的比例約為 15:1,而 WT BerS 的比例約為 17:1 和 10:1(圖 6)。S82 的小羟基側鍊指向 BerS 活性位點的底物 C7(圖 1D),這是紅沒藥醇陽離子在通向反式-α-香檸檬烯的途中正電荷積累的位置(圖 3)。在含有 3 個 Mg2+ 離子和 FPP 的 BerS 的 MD 模拟中,S82O – C7 距離相對穩定,平均距離約為 6 Å,最小距離為 4.4 Å。是以,該羟基可能與 C7 上的正電荷互相作用,進而穩定紅沒藥基陽離子的形成,正如先前假設的那樣。在 S82L 變體中,将該殘基突變為亮氨酸會破壞這種穩定互相作用,進而可能阻止紅沒藥基陽離子的形成,是以阻止反式香檸檬素的形成。然而,由于紅沒藥基陽離子源自已異構化的橙花叔醇基陽離子(圖 3),這可能不是 BerS-S82L 變體産品特征發生變化的原因,盡管總體産品滴度增加,但橙花叔醇和芳樟醇(也已異構化)的産量與 WT-BerS 和 BerS-L86F 相比最低。然而,S82 仍可能在 WT BerS 和 BerS-L86F 中的反式-α-香檸檬烯合成中發揮作用。相反,BerS-S82L 的效果更可能類似于上述植物 TPS 的效果,與絲氨酸相比,亮氨酸的尺寸增加會阻止異構化步驟。通常情況下,異構化會使 C1-C2 烯丙基鍵靠近 C6=C7 雙鍵,然後 1,6 環閉合産生紅沒藥基陽離子(圖 3)。亮氨酸側鍊的額外空間體積會減少異構化步驟可用的空間,可能是通過壓縮底物進而阻止必要的環閉合步驟,盡管在這種情況下,中斷導緻了替代環化途徑而不是非環狀産物的形成。酶在此位置對空間需求的敏感性進一步由 BerSS82Y 無活性得到證明,即使對于從短鍊 GPP 形成單萜類化合物也是如此。是以,S82 在 BerS WT 中的存在可能代表了向反式 α-香檸檬烯生物合成的進化程序,因為已知 TPS 會犧牲活性以更好地控制複雜産品的形成。

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圖6

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BerS-S82L 阻止異構化

有趣的是,BerS-L86F 的結果與 TPS10 類似物相反,因為較大的殘基的取代增加了由橙花烷基陽離子産生的産物的比例。這表明 BerS-L86F 中産物比例變化的機制解釋不同。衆所周知,電離和異構化是 TPS 催化中最慢的化學步驟。9在 I 類 TPS 中,效應羰基孤對電子密度被捐贈到底物 C2=C3 鍵的 π* 分子軌道中,進而引發電離。BerS 中的 L86 類似于 NerS 中的 F79。事實上,正是在此基礎上,它被突變為芳香族殘基:苯丙氨酸能夠在電離後通過陽離子-π 互相作用穩定 C3 上的正電荷,是以可以提高活性和/或異構化。

由于苯丙氨酸比亮氨酸大,是以該變體中異構化産物的增加不太可能是由于底物自由度增加,就像上述 TPS10 類似物的情況一樣(以及前面讨論過的青蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶和 (E)-β-法呢烯合酶 13)。是以,推測該 BerS 變體中的主要效應是電子效應,源于 L86F 通過與新形成的碳正離子的有利陽離子-π 互相作用來啟動和穩定電離和異構化的能力增強。BerS-L86F 中 (E)-β-法呢烯:反式-α 香檸檬烯和法呢醇:橙花叔醇的比例變化支援了這一點。在 WT BerS 中,這些比例分别為 ~17:1 和 ~10:1,表明對法呢基陽離子衍生産物的強烈偏好。在 BerSL86F 中,這些比率分别低得多,約為 10:1 和 4:1,這意味着 BerS-L86F 具有更好的将法呢基異構化為橙花烷基陽離子的能力,這與 BerS-S82L 觀察到的變化相反(圖 6A)。我們還觀察到這種變體中存在少量 β-紅沒藥烯,這是一種在 WT BerS 中未觀察到的異構化環狀倍半萜。該産品是通過 C15 處的紅沒藥基陽離子去質子化而獲得的(圖 3),進一步表明 BerSL86F 通過異構化和随後的環閉合達到紅沒藥基陽離子的能力有所提高。催化活性的增加(體外證明,見下文)也可能意味着啟動反應的電離步驟有所改善,因為這通常是 TPS 的限速步驟。

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WT BerS 和 BerS-L86F 與 GPP 和 NPP 的孵育

為了進一步探究 BerS-L86F 與 WT BerS 相比活性和異構化明顯改善的原因,将兩種酶純化并與天然 mTPS 底物 GPP 以及焦磷酸橙花酯 (NPP) 一起孵育,後者也是 C10,但已經異構化。NPP 不是 NerS 和 BerS 的天然底物,盡管它是某些 TPS 的天然底物。然而值得注意的是,雖然 GPP 是單萜生物合成的天然底物,但 BerS 是一種倍半萜合酶 (sTPS),其真正底物是 C15 FPP。也許正是由于這個原因,當與 GPP 一起孵育時,在 37 °C 下 30 分鐘後未檢測到 WT BerS 的産物。将 NPP 喂給 WT BerS 也沒有産生可檢測的産物,這表明電離可能是限速因素,或者 WT BerS 隻是無法與這些較短底物形成适當的 Michaelis 複合物,而與 FPP 相比,FPP 檢測到了産物。如後面所述,BerS 相對于 FPP 轉化為其主要産物 (E)-β-法呢烯的周轉數計算為 37 °C 時僅為 0.018 min-1,是以沒有檢測到 GPP 的産物可能并不奇怪,GPP 不是 BerS 的主要底物。然而,檢測到了 BerS-L86F 的産物,進一步證明了體内觀察到的活性改善(圖 6B)。香葉醇和橙花醇分别由 GPP 和 NPP 水解産生。體外對照反應中不存在這些化合物,表明這是酶催化的,盡管由于作者的即插即用系統中異源 MVA 途徑和 GPP 合酶的過度表達,體内也觀察到了明顯更多的非酶香葉醇。至關重要的是,與 BerS WT 不同,BerS-L86F 能夠将非異構化 GPP 轉化為可檢測量的異構化芳樟醇,這進一步表明新的芳香環在促進陽離子-π 互相作用的異構化中發揮作用。橙花醇(源自 NPP)的存在也表明 BerS-L86F 具有更适合異構化底物的活性位點輪廓,這與 FPP 中複雜異構化産物(如反式-α-香檸檬烯和新出現的 β-紅沒藥烯)産量增加相一緻。

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利用圓二色性探測 NerS 和 BerS 的潛在熱穩定性

由于 NerS 和 BerS 是從耐熱細菌 Rubrobacter radiotolerans 的基因組中挖掘出來的,是以使用圓二色性 (CD) 測試了它們的潛在熱穩定性。首先,從 180-260 nm 掃描 NerS 和 BerS(含有鎂離子),以找到特征性的 α-螺旋吸收信号。兩種酶在預期的 210 nm 波長處均顯示出強吸光度。接下來,在測量 210 nm 處 CD 信号變化的同時進行溫度斜坡分析。拟合 CD 測量曲線可得出每種酶的熔化溫度 (TM)。NerS 的 TM 為 47.6 °C ± 0.4,而 BerS 的 TM 為 44.4 °C ± 0.4,這表明 NerS 比 BerS 更耐熱。然而,TM 可能與最适溫度沒有直接關系,因為酶功能可以在結構降解開始後保留一段時間。同樣,在達到熔化溫度之前,活性可能會停止。是以,需要進行溫度控制測定來确定最适溫度。由于 TPS 在底物結合時會發生顯著的動态重排,并且這些構象變化可能會影響熱穩定性,是以 CD 溫度測定通過在測定緩沖液中添加 [10x] PPi 重複上述步驟。PPi 模拟 FPP 中的 PPi 部分,可以與三核鎂簇結合,也可以與效應殘基和活性位點親水區的其他堿性殘基複合。這些誘導契合度變化可能導緻酶剛性增加,進而提高熱穩定性。然而,在 PPi 存在下,NerS 和 BerS 的熔化溫度均保持不變(47.4 °C ± 0.5 和 44.2 °C ± 0.3 相比 47.6 °C ± 0.4 和 44.4 °C ± 0.4),這表明 PPi 的存在對蛋白質剛性或熱穩定性沒有影響。完全誘導契合可能需要天然底物或類似物的存在,而不僅僅是 PPi 成分。

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NerS 和 BerS 的酶動力學和溫控測定

使用過量 FPP 的純化酶測定法測定了 NerS 和 BerS 的周轉數(相對于 FPP 轉化為橙花叔醇或 (E)-β-法呢烯)。為了進一步探究這些酶的潛在熱穩定性,這些周轉測定是在不斷升高的溫度下進行的。如圖 7A 所示,50 °C 時 NerS 的周轉數為 0.38 min-1,比 30 °C 時的 0.11 min-1 快三倍多。然而,在 37 °C 時,周轉數為 0.31 min-1,這幾乎占了這一差異的四分之三。FPP 轉化為橙花叔醇的最佳溫度似乎在 50 °C 左右,活性在 55 °C 時下降,在 60 °C 時檢測不到。這與通過圓二色性測定的 NerS 的熔化溫度 47.6 °C 一緻。盡管 NerS 可能在 45 °C 及以上開始失去一些結構組織,但它必須保留一些催化功能。系統中動能的增加也可能導緻整體周轉率更高。這對于 TPS 來說具有先見之明,因為産品釋放被認為是最慢的非化學步驟。8 是以,酶:産品複合物中動能的增加可能有助于産品釋放。如圖 7B 所示,在測試的測定條件下,BerS 的周轉率比 NerS 低得多。在 30 °C 時,在 (E)-β-法呢烯的預期保留時間檢測到的産品處于 GCMS 可檢測極限的門檻值上,是以定量太困難了。從 37 °C 到 45 °C 有所升高,但在 50 °C 時未觀察到任何活性。即使不考慮反式-α-香檸檬烯産量的增加,BerS-L86F 變體在 37 °C 時 (E)-β-法呢烯形成的周轉數 (0.026 min-1) 也高于 WT BerS 在 37 °C (0.018 min-1) 或 45 °C (0.024 min-1) 時的周轉數。BerS-L86F 與 FPP 的活性改善與在體内和體外 GPP 和 NPP 測定中觀察到的結果一緻。

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NerS 具有中等耐熱性

是以,NerS 似乎具有一定的耐熱性,在 ~50 °C 時表現出最佳催化活性,并在高達 55 °C 的溫度下仍能保持活性。這比報道的 TPS 的平均最适溫度要高得多,盡管低于之前報道的熱穩定 TPS12 和專門為增強熱穩定性而設計的 TPS32,後兩者均表現出高達 65 °C 的活性。NerS 在較高溫度下的反應速度在與較低溫度下相同的時間段後達到穩定狀态,很可能是由于酶吸附到檢測管上。如果蛋白質在這些較高溫度下不穩定,人們可能會看到初始産物形成急劇增加,然後迅速下降,但事實并非如此。類似地,對照反應排除了在較高溫度下 FPP 溶劑分解增加導緻産物形成增加的可能性,而對同樣将 FPP 轉化為橙花叔醇的 bLinS 進行的相同分析導緻 37 °C 以上活性顯著喪失。對于這些由于這些原因,與酶的典型最适溫度接近(或低于)37°C 相比,NerS 确實具有一定程度的耐熱性。如上所述,底物隔離引起的蛋白質構象變化可能對 NerS 的耐熱性有積極作用。第二輪圓二色性分析僅測量了 PPi 的影響,而不是整個底物。由于溫控動力學分析是使用天然底物 FPP 進行的,是以這些動态效應可能存在并可能解釋 NerS 的耐熱性,但還需要做更多的工作來确定是否有其他因素在起作用。相比之下,CD 實驗和溫控分析表明 BerS 不具備任何有意義的耐熱性.

ChemBioChem. |蔗糖合酶糖基化級聯法制備黃酮類化合物的産物及反應條件研究

圖7