今天给大家介绍的是由美国达纳-法伯癌症研究所Katherine A. Donovan等人在Cell上发表的文章” Mapping the Degradable Kinome Provides a Resource for Expedited Degrader Development”。
靶向蛋白降解（targeted protein degradation, TPD）是利用小分子（降解剂）来诱导蛋白泛素依赖性降解。由于TPD可以处理先前无法访问的靶标，因而引发了药物研发者的兴趣。然而，降解剂的发现与优化依旧是一个低效的过程，这是由于缺乏对诱导靶标降解关键分子事件相对重要性的理解。作者构建的数据集为大约200中激酶提供了化学指南，并且证明了从最高效结合开始的策略是低效方法。作者开发了多靶标降解模型来回答泛素蛋白酶系统最基础的问题，并揭示了激酶降解是p97依赖的。
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介绍
TPD是一种新兴的治疗手段，它可以克服传统药物抑制方法的限制。TPD利用小分子来通过连接E3泛素连接酶和感兴趣的蛋白质（proteins of interest，POI）来诱发细胞降解机制，如图1所示。由于一个降解剂分子可以降解多个蛋白分子，这个疗效的提高提供了光明前景。这种独特的机制被称为事件驱动药理学（event-driven pharmacology）。降解物导致了蛋白质酶和非酶功能的损失，例如激酶的支架功能。TPD可以结合人类蛋白组剩下80%的那些曾认为是不可降解的靶标。
图1：目标蛋白降解作用模式
尽管现在已经对TPD进行了广泛的探索，但是它仍然很难预测哪些蛋白质是简单易处理的，哪些会抵触这种方法。类似地，由于结合的非线性依赖，降解靶标剖面通常与亲代抑制剂选择性剖面有很大差异，因此，大型经验数据集对建立TPD靶标空间非常重要。
作者选择关注激酶，这是因为它基因家族的大小，化学上不同结合物的可用性，以及高翻译的潜力。尽管被FDA认可的小分子激酶抑制剂数量不断增加，但只有7%的人类激酶组已经用于治疗探索，并且还有更多的激酶靶标等待发现。本文中，作者构建了一个可降解激酶的实验图谱，它可把所有的激酶分支作为靶标，并且包含超过200种激酶，这些资源都放在了网络上(https://proteomics.fischerlab.org)。这些资源可以加快化学探针的开发、药物发现和蛋白质降解途径的基础研究。
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结果
2.1 可降解激酶的实验图谱
2.1.1 绘制可降解激酶图
人类蛋白激酶超家族由514个蛋白激酶组成，占人类总基因组的2.5%。利用PDB数据，作者开发了一个大型的激酶靶向降解剂库作为一个工具集来定义可降解的激酶组，这个库包含了多种激酶靶向骨架和结合模式。最后，研究者基于多靶标激酶抑制剂合成了几种降解剂。为了增加三元络合物形成的概率，作者采用了多种连接体长度、组合和连接化学，并结合了针对双靶标的E3连接配体进入库设计，如图2所示。在相关连接酶参与测定中，降解剂对细胞通透性进行了初步筛选，最终选择了91个化合物，过程如图3所示。
图2：降解剂库特征
图3：实验步骤
研究者使用全局蛋白组通过测量结合激酶降解剂分子后的蛋白丰度变化来确定靶标，识别出212个蛋白激酶/与激酶关联的靶标。此外，研究者的数据集识别了目前TPD技术可能难以降解的激酶，并对它们的二元靶标结合、三元络合物形成和表达谱进行了表征。
2.1.2 可降解得分
靶标配位性的测量是靶标优先排序的关键。尽管靶向蛋白降解剂的开发需要一个POI结合剂，研究者假设不同的靶标对目前降解介导的破坏方法有不同的倾向，称之为“降解性”。为了评估降解性，研究者确定了155次处理中每种蛋白激酶的降解频率。研究者合理地认为，在多种治疗中识别同一激酶为假阳性的概率很低，因此该分析也有助于评估数据和后续解释的稳健性。
为了评估多靶标降解剂分子SK-3-91的转录变化反应，研究者进行了一次RNA序列实验，发现数据库不太可能转录下调。接下来，研究者更正了在整个数据集中分子的过度表示的降解评估的频率，这就可以计算可降解性得分。研究者利用已发表的文献来评估低估了的激酶可降解性的程度。
2.1.3 可降解激酶数据集加速先导物发现
当前给特定靶标设计降解剂，通常开始识别一个高亲和力结合配体，然后合成一个分子库。拥有最佳化学型-靶标对的先验知识来启动靶向蛋白降解剂发现项目，也已加快命中时间。研究者提供的化学蛋白组数据提供了靶标可处理性和针对新靶点潜在起点的关键信息。同样重要的是数据集中包含了目前不可降解的酶，并揭示了对特定不活跃激酶靶点的化学结构。
2.2 研究化学和细胞变量对TPD结果的影响
2.2.1 TPD结果变量
作者研究了细胞事件包括细胞靶标接触，三元络合物的形成，靶标蛋白质风度，泛素蛋白质系统（ubiquitin proteasome system， UPS)的表达和ABC-drug转运蛋白，靶蛋白的半衰期，细胞系方差，改变E3连接酶的影响，以及化学变量如连接体长度和退出向量。
2.2.2 细胞靶标参与不能预测降解效率
研究者选择了四种可以大量诱导激酶降解的降解剂，为了计算在细胞系中激酶靶标的占有率，研究者对每一种降解剂都进行了KiNativ分析。结果表明在两个实验中大约170个激酶被量化，47个在至少有一个降解剂有显著参与。研究者发现细胞靶标结合和降解效力之间没有相关性，这表明靶标结合并不是驱动降解效果的主要因素。此外，降解激酶的比例与不同化合物结合的变化很显著，并且与细胞通透性无关。研究者还发现有些激酶可被高亲和力降解剂降解，而不能被弱亲和力分子降解。
2.2.3 稳定的三元络合物不能预测降解效果
研究者发现在AP-MS实验中全局激酶在相应的整体蛋白组学分析中被降解。然而，在实验中每个分子中降解激酶形成可检测三元复合物的比例很低。研究者观察到与所有化合物形成生产性和非生产性三元络合物的证据。总之，实验数据突出了复杂的细胞环境和降解分子的亚化学计量模式的行动解耦单一分子事件。
2.2.4 靶蛋白丰度不能预测降解剂效果
研究者观察到依赖于细胞系的每个分子的降解激酶靶标数量的差异，虽然这些差异中有一小部分是由激酶检测的差异引起的，但总的来说，在降解剂处理后，没有观察到3个细胞系中蛋白表达和蛋白丰度FC之间存在线性关系。
2.2.5 不同E3连接酶会影响降解剂的靶标空间
为了评估改变靶标骨架对E3连接酶影响可触及靶标范围的能力的影响，研究者比较了三对匹配的多靶标激酶降解物在MOLT-4细胞中的降解情况，发现许多激酶在不止一对上显示了相同的连接酶偏好，而且这种偏好在整个可降解激酶组数据库中都是真实的。
2.2.6 蛋白激酶和亚胺脱靶对连接体设计的细微变化有不同的耐受性
研究者合成了六种多靶标激酶降解剂来系统地评估细微的连接体差异的重要性，发现在26个激酶中，有一个子集在所有6种化合物中降解程度相当，这表明它们对连接体的改变具有高度的耐受性，表明这些特定激酶可能具有多种复合构象的能力。整个数据集中，这个集合被发现是高度可降解的，这表明三元复合物的可塑性可能是高度可降解靶标的一个重要特征。
2.2.7 大多数激酶的蛋白酶体降解依赖于p97
为了评估p97在激酶组中的依赖性，研究者测量了单独使用四种多激酶靶向降解物处理后蛋白丰度的变化，并与p97抑制剂CB-5083共同处理进行了比较。对四个处理组的分析显示，几乎所有响应降解处理下调的激酶在p97被抑制时都表现出一定的降解拯救。结果表明，p97在将底物移交给蛋白酶体方面的作用不仅限于从大细胞结构中提取蛋白质，还包括解开可溶性多聚泛素化蛋白。
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结论
本文对激酶组的降解性进行了广泛的分析，以解决目前缺乏数据集来提取TDP介导降解的一般特征的问题。本文结合了降解剂数据库，利用基于质谱分析的定量蛋白质组学绘制了200多个激酶在7个不同细胞系的图谱。
研究者发现了超过16种未被研究的激酶的活性降解分子，并证明了数据库可以作为一个丰富的小分子工具的来源，以研究泛素蛋白酶体系统的基础生物学。尽管关于p97在促进激酶的蛋白酶体降解方面的作用还有很多有待了解，但本研究证明了收集的多靶点降解物如何被利用来揭示UPS扰动对各基因家族蛋白降解的影响。
参考资料
Donovan K A , Ferguson F M , Bushman J W , et al. Mapping the Degradable Kinome Provides a Resource for Expedited Degrader Development[J]. 2020.
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.10.038