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剖析HER2低表达乳腺癌的检测标准化、异质性以及AI辅助IHC判读的应用前景。
人表皮生长因子受体 2(HER2) 是预测乳腺癌HER2靶向治疗预后和有效性的重要生物标志物。新型HER2抗体药物偶联物（ADC）的出现使得HER2 状态的二元分类（即阳性和阴性）逐渐向三元分类（即HER2 0、HER2低表达和HER2阳性）转变。乳腺癌HER2低表达的异质性一直以来备受关注，这种异质性直接影响了HER2靶向治疗的疗效。因此，准确识别乳腺癌的HER2表达状态至关重要。近年来，人工智能 (AI) 发展迅速，已广泛应用于乳腺癌病理诊断领域。研究显示，AI可以显著提高病理学家在乳腺癌HER2判读中的一致性和准确性。目前在HER2低表达乳腺癌领域，针对其检测前的质量控制、肿瘤异质性的最新进展以及AI的应用等方面，已经引发了广泛而深入的讨论。近期，河北医科大学第四医院刘月平教授发表了一篇综述报道《HER2-low breast cancer: insights on pathological testing》，旨在深入探讨HER2低表达乳腺癌的最新检测指南及进展，以期规范和完善该疾病的病理检测流程，为乳腺癌患者提供更加精准和个性化的治疗方案。
HER2低表达乳腺癌检测前的质量控制
2021版法国HER2检测指南强调了HER2检测前质量控制的重要性。具体来说，样本的冷缺血时间必须尽可能短，活检样本在几分钟内固定，手术标本在一小时内固定。推荐的固定液为10%中性福尔马林缓冲液，固定时间为6-72小时[2]。此外，除冷缺血时间和固定时间外，生物标志物的检测还可能受到组织处理过程中各种因素的影响。举例来说，在石蜡切片中，HER2的免疫反应性随着时间的推移呈现出逐渐恶化的趋势。Mirlacher 等人[3]在相同的实验条件下分析4℃下储存6个月的切片和新鲜切片，结果显示，与新鲜切片相比，贮存切片中HER2 阳性率从16.3%降至9.6%(P=0.0047)。本研究证实了石蜡切片储存时间对免疫组化 (IHC) 分析结果的显著影响。Forse 等人的研究[4]证明未染色石蜡切片-80℃长期保存对乳腺癌HER2评估无明显影响。不同石蜡切片储存条件和时间会影响乳腺癌标本的IHC检测结果。
鉴于HER2低表达概念的正式提出，使得区分HER2 IHC 0和1+显得尤为重要，然而IHC 0和1+之间的差异极小，因此探索未染色石蜡切片储存时间对HER2低表达IHC检测结果的影响非常关键。这是为了避免由于储存时间过长而导致HER2低表达乳腺癌的误判，从而影响治疗决策和患者预后。《中国乳腺癌HER2 检测指南（2019版）》建议未染色切片在室温下放置不应超过6周，以防止抗原丢失。
河北医科大学第四医院研究团队针对石蜡切片保存时间对浸润性乳腺癌HER2表达的影响进行了深入的探索，并于2023年在第112届USCAP年会上公布。结果显示，长期储存未染色的石蜡切片会导致HER2表达水平下降，尤其是在HER2低表达乳腺癌患者中。对于乳腺癌未染色的石蜡切片，建议在4周内进行HER2染色，以防止抗原丢失[5]。如果进行HER2检测的切片储存时间延长且表达呈阴性，建议使用新鲜切片重新检测。然而，这些结果需要大量临床研究进一步验证。
不同HER2检测抗体的特异性和灵敏度不同
目前几种HER2 IHC检测抗体用于检测乳腺癌中HER2蛋白表达，它们在特异性和敏感性上存在差异。一项研究显示[6]，HercepTest和PATHWAY 4B5在检测HER2阴性（IHC 0、1+、2+，无ISH基因扩增）和阳性（IHC 3+、2+，有ISH基因扩增）病例方面具有高度一致性（98.2%）。在PATHWAY 4B5判读为完全阴性的41例肿瘤中，仅19例 (46.3%) 在使用 HercepTest(mAb) 时未染色，对应于根据Ventana评分算法更严格定义的IHC 0类别。其余8例采用HercepTest染色评估为HER2低表达（7例IHC 1+和1例IHC 2+伴FISH阴性）；14例为HER2超低表达（肿瘤细胞阳性百分比<10%）。该研究表明HercepTest在HER2低表达检测中具有更高的灵敏度。与HercepTest相比，Pathway 4B5显示出细胞质非特异性染色；与Pathway 4B5不同，HercepTest在一些正常乳腺导管细胞中显示弱至中等强度染色。这表明不同HER2抗体染色的特异性存在差异。期待更多研究针对多种HER2抗体在检测HER2低表达发生率方面的影响进行深入探讨，以期更为精准地筛选出能够从HER2低表达靶向治疗中获益的特定人群。
HER2低表达异质性检测
基因异质性和蛋白异质性是HER2表达肿瘤瘤内异质性 (ITH) 的两个重要部分。ASCO/CAP（2013版）建议将HER2基因异质性定义为存在HER2拷贝数和/或 HER2/CEP17比值不同的单个细胞群，至少占整个肿瘤细胞群的10%。2023年英国HER2检测指南指出，在HER2蛋白表达水平上，异质性被定义为在<10%的肿瘤中有完整、强或中等细胞膜染色的任何细胞簇（亚克隆）；并且IHC 2+应通过原位杂交 (ISH) 进行检测。如果亚克隆细胞在<10%的其他区域阴性肿瘤中显示弱染色，则肿瘤评分为1+。因此，需要仔细检查粗针穿刺活检 (CNB) 标本，以识别具有不同HER2染色模式的肿瘤细胞群。
2022年发表在《现代病理学》上的一项研究显示[7]，281例乳腺癌患者中有31%为HER2 低表达，其中HER2 IHC 1+异质性较大。因此，准确识别HER2低表达的异质性对于制定合适的治疗方案和预测乳腺癌患者的预后至关重要。2021版法国HER2检测指南（2021版）建议明确报告HER2 IHC检测结果的三个组成部分，包括HER2染色细胞膜的完整或不完整性、染色强度（需要在高倍镜下仔细观察）以及阳性浸润肿瘤细胞的百分比。
近年来，研究者提出了一种称为HER2微异质性的HER2异质性的新概念。目前依靠基因-蛋白检测 (GPA) 方法进行检测，这种技术由 Downs-Kelly 等首先开发[8]，它结合了HER2 IHC和HER2 ISH检测方式，可以在同一组织切片上同时进行，允许病理学家在单细胞水平对HER2基因和HER2蛋白表达水平进行评分。Nitta 等人的研究结果[9]表明该方法可以检测HER2基因扩增而HER2蛋白不过度表达的乳腺肿瘤细胞群。HER2基因与蛋白在单个细胞水平上的这种错配被称为“HER2微异质性”。Osamura等人的研究结果[10]提示HER2微异质性可能是HER2靶向治疗耐药的生物学机制。HER2微异质性异种移植模型研究表明，抗HER2抗体的疗效取决于过表达HER2蛋白的HER2基因扩增肿瘤细胞与不表达HER2蛋白的HER2基因扩增肿瘤细胞的比值[11] 。因此，进一步探索HER2微异质性可能是HER2异质性研究的方向之一。
AI 辅助HER2低表达乳腺癌精准诊断的进展
近年来，AI在辅助HER2低表达乳腺癌IHC精准判读方面发展迅速。Marra 等人[12]以IHC和HER2 mRNA表达相结合为金标准，试图通过深度学习方法，使用苏木精-伊红 (H&E) 染色切片的全玻片图像 (WSI) 预测乳腺癌的HER2状态。当区分HER2低表达、HER2扩增和HER2真阴性的病例时，模型的受试者工作特征曲线面积达到0.78，敏感性为76%，特异性为73%，阳性预测值为97%，阴性预测值为21%，F1评分为0.85，表明AI模型可以区分完全缺乏HER2蛋白表达和mRNA的肿瘤与HER2低表达肿瘤。Atallah等人[13]通过AI模型基于mRNA水平对HER2 IHC 0和1+的阈值进行了精细化和重新定义，提出将HER2 >10%微弱不完整膜染色的阈值更新为≥20%。该研究对HER2在不同表达模式下的阈值进行了调整，展示了改进评分与临床病理学特征之间更密切的关联。
河北医科大学第四医院研究团队曾深入探索了AI在乳腺癌HER2 IHC 0和1+准确区分中的应用[14]，结果表明，AI辅助判读显著提升了病理学家对HER2 IHC 0和1+判读的精确性和一致性，特别是在HER2 IHC 1+病例中。此外，在HER2异质性病例中AI也能提高判读的准确性，尤其在散在型病例中表现突出。这项研究首次证实了AI在辅助病理学家区分HER2 IHC 0和1+以及提升异质性病例判读质量中的实用价值。值得注意的是，2023版英国HER2检测指南建议在将AI应用于临床实践之前，需要进行严格的验证和质量控制。在存在异常染色模式的情况下，自动图像分析技术判读HER2的准确性仍待进一步评估，定期的审查和监测将有助于降低错误分类的风险。目前，自动图像分析技术和AI模型尚未获批用于常规诊断中的HER2状态评估。然而，若未来出现新的可靠证据，将对此进行审查，并制定相应的评价计划。
结论
近年来，病理学家一直关注未染色石蜡切片的保存时间和保存条件对HER2低表达IHC染色的影响，河北医科大学第四医院研究结果显示室温保存石蜡切片的最佳时间为4周内，可有效避免抗原的丢失。异质性在HER2低表达乳腺癌中较为常见，并且HER2微异质性对于进一步细分HER2异质性提出了更高的要求。既往研究也表明HER2微异质性可能影响HER2靶向治疗的疗效，其在HER2靶向治疗耐药中的生物学机制及预测乳腺癌预后方面的潜在作用仍需大型多中心研究进一步探讨。随着AI技术的飞速发展，其在辅助IHC定量分析方面的作用日益凸显。相信随着研究的进一步深入，AI将协助病理医生解决HER2低表达乳腺癌病理诊断的痛点和难点，为乳腺癌的精准诊疗提供有力支撑，并最终使乳腺癌患者受益。
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参考文献：
[1]Liu Y. HER2-low breast cancer: insights on pathological testing. Transl Breast Cancer Res. 2023 Apr 30;4:15.
[2]Franchet C, Djerroudi L, Maran-Gonzalez A, et al. 2021 update of the GEFPICS' recommendations for HER2 status assessment in invasive breast cancer in France. Ann Pathol 2021;41:507-20.
[3]Mirlacher M, Kasper M, Storz M, et al. Influence of slide aging on results of translational research studies using immunohistochemistry. Mod Pathol 2004;17:1414-20.
[4]Forse CL, Pinnaduwage D, Bull SB, et al. Fresh Cut Versus Stored Cut Paraffin-embedded Tissue: Effect on Immunohistochemical Staining for Common Breast Cancer Markers. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2019;27:231-7.
[5]He J, Liu H, Liu Y. Effect of Paraffin Sections Preservation Time on HER2 Expression in Invasive Breast Cancer. United States & Canadian Academy of Pathology 112th Annual Meeting Abstracts, 2023.
[6]Rüschoff J, Friedrich M, Nagelmeier I, et al. Comparison of HercepTest™ mAb pharmDx (Dako Omnis, GE001) with Ventana PATHWAY anti-HER-2/neu (4B5) in breast cancer: correlation with HER2 amplification and HER2 low status. Virchows Arch 2022;481:685-94.
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[9]Nitta H, Kelly BD, Padilla M, et al. A gene-protein assay for human epidermal growth factor receptor 2 (HER2): brightfield tricolor visualization of HER2 protein, the HER2 gene, and chromosome 17 centromere (CEN17) in formalin-fixed, paraffin-embedded breast cancer tissue sections. Diagn Pathol 2012;7:60.
[10]Osamura RY, Kuwayama A, Katoh M. Simultaneous phenotypic and genotypic heterogeneity at the cellular level approached by HER2 gene-protein assay (GPA) in the invasive ductal carcinoma of the breast: a new approach for cancer pathobiology. San Antonio Breast Cancer Symposium 2013: abstract P4-06-12.
[11]Song H, Kim TO, Ma SY, et al. Intratumoral heterogeneity impacts the response to anti-neu antibody therapy. BMC Cancer 2014;14:647.
[12]Marra A, Goldfinger M, Millar E, et al. 93P An AI-driven computational biomarker from H&E slides recovers cases with low levels of HER2 from immunohistochemically HER2-negative breast cancers. Ann Oncol 2022;33:581.
[13]Atallah NM, Toss MS, Green AR, et al. Refining the definition of HER2-low class in invasive breast cancer. Histopathology 2022;81:770-85.
[14]Wu S, Yue M, Zhang J, et al. The Role of Artificial Intelligence in Accurate Interpretation of HER2 Immunohistochemical Scores 0 and 1+ in Breast Cancer. Mod Pathol 2023;36:100054.
审批编号：CN-139750 有效期至：2024-10-22
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