引言
在現代生命科學研究中，質譜細胞術(Mass Cytometry)通過使用金屬同位素标記的抗體來标記感興趣的目标，能夠同時測量數百萬個單細胞中的大約50種蛋白質或蛋白質修飾。然而，目前的質譜細胞術在靈敏度方面存在限制，通常需要數百個金屬标記的抗體結合到每種細胞表位上才能達到儀器的檢測門檻值。這限制了低豐度蛋白質組分的分析，包括許多轉錄因子、表面受體蛋白和細胞内磷酸化位點，這些組分在健康和疾病中起着重要作用。7月29日Nature Biotechnology的研究報道“Signal amplification by cyclic extension enables high-sensitivity single-cell mass cytometry”，介紹了一種稱為循環擴增放大(Amplification by Cyclic Extension, ACE)的新型信号放大技術，通過熱循環DNA原位連接配接和3-氰基乙烯基咔唑(3-cyanovinylcarbazole)磷酰胺的DNA交聯來實作信号放大。ACE技術能夠在超過30種蛋白質表位上同時進行信号放大，顯著提高了低豐度蛋白質的檢測靈敏度。研究團隊通過懸浮質譜細胞術展示了ACE技術在表征上皮-間充質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)和間充質-上皮轉化(mesenchymal-to-epithelial transition, MET)過程中的分子重程式設計中的應用。同時，ACE技術還展示了其在定量分析人T淋巴細胞信号網絡響應動态中的能力。此外，通過結合成像質譜細胞術(imaging mass cytometry, IMC)，ACE技術能夠進行多參數組織成像，識别組織區室并分析與病理狀态相關的空間特征。該研究表明，ACE技術不僅解決了質譜細胞術在靈敏度上的挑戰，還能夠在單細胞水準上分析低豐度蛋白質組分，拓展了質譜細胞術在生命科學研究中的應用潛力。通過對人腎髒組織進行IMC分析，ACE技術揭示了腎髒皮質中的六個主要區室，并展示了多囊腎病(polycystic kidney disease)組織中幹細胞标志物nestin表達水準的異質性。總體而言，ACE技術為質譜細胞術分析提供了一種高靈敏度的方法，使得單細胞層面低豐度蛋白質組分的譜繪成為可能，并對相關疾病的研究和診斷提供了重要的技術支援。
質譜細胞術(Mass Cytometry)是一種通過使用金屬同位素标記的抗體來标記感興趣目标的技術，能夠在單細胞水準上同時測量數百萬個細胞中的大約50種蛋白質或蛋白質修飾。然而，目前的質譜細胞術在靈敏度方面存在限制，通常需要數百個金屬标記的抗體結合到每種細胞表位上才能達到儀器的檢測門檻值。這一限制阻礙了低豐度蛋白質組分的分析，包括許多在健康和疾病中起重要作用的轉錄因子、表面受體蛋白和細胞内磷酸化位點 。
為了克服質譜細胞術的靈敏度限制，研究團隊開發了一種新型的信号放大技術，稱為循環擴增放大(Amplification by Cyclic Extension, ACE)。該技術通過熱循環DNA原位連接配接和3-氰基乙烯基咔唑(3-cyanovinylcarbazole, CNVK)磷酰胺的DNA交聯來實作信号放大。
研究中使用了小鼠乳腺癌Py2T細胞，首先用4ng/ml的轉化生長因子β1(TGFβ1)處理14天以誘導間充質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)，然後去除TGFβ1，使細胞在接下來的14天内回複到上皮狀态(mesenchymal-to-epithelial transition, MET)。在這一過程中，在不同的時間點(0、1、2、3、6、9、14、17、21、24、28天)收集細胞樣本。
循環擴增放大(Amplification by Cyclic Extension, ACE)技術及其應用的示意圖（Credit: Nature Biotechnology）
ACE方法概述：圖a較長的描述了ACE方法的工作原理，包括初始标記、引物延伸、熱循環和金屬探針雜交等步驟。展示了如何通過多次熱循環擴增引物鍊，進而顯著放大每個抗體上的金屬信号。懸浮質譜細胞術中的應用：圖b展示了ACE在懸浮質譜細胞術中的應用，說明ACE技術可以放大信号，使得低豐度标志物在質譜細胞術中的檢測和定量成為可能。成像質譜細胞術中的應用：圖c展示了ACE與成像質譜細胞術(Imaging Mass Cytometry, IMC)結合的應用。圖中顯示了ACE技術在組織樣本中的高靈敏度多參數空間分析，能夠識别健康和病變組織樣本中的細胞群組織區室。
循環擴增放大初始标記：将靶向蛋白質的抗體首先與短DNA寡核苷酸引物(TT-a, 11-mer)結合。标記應用：将結合了引物的抗體應用于細胞懸液，進行細胞表面或細胞内标記。引物延伸：引入含有與引物互補的延伸寡核苷酸(a*-T-a*, 19-mer)，在适當溫度下進行雜交，通過Bst聚合酶介導引物鍊的擴增。熱循環：通過多次熱循環(每循環1分鐘)，逐漸延伸引物，形成數百個重複序列。金屬探針雜交：最後，将含有金屬離子的探針與延伸後的引物雜交，進而顯著放大每個抗體上的金屬信号。
ACE技術在質譜細胞術中的驗證和信号放大的定量結果（Credit: Nature Biotechnology）
HEK293T細胞驗證：圖a展示了使用綠色熒光蛋白(GFP)瞬時轉染的HEK293T細胞來驗證ACE放大方法的實驗設計。通過對GFP表達的細胞進行ACE放大，與正常的熒光标記抗體和免疫SABER(免疫滾環擴增)放大進行比較，驗證ACE的特異性和放大效率。信号相關性：圖b展示了ACE放大通過1至500次熱循環的信号放大效果，并與傳統的金屬标記次級抗體進行比較。結果表明，ACE放大的GFP信号與次級抗體信号之間的Pearson相關系數在各個條件下均較高，驗證了ACE在細胞内表位染色中的特異性。信号增強和特異性：圖c和d展示了通過不同熱循環次數的信号增強效果。資料被分成10個等寬的區間，顯示了每個區間的中位數在不同熱循環次數下的變化。結果表明，前100個循環(大約2小時)内信号放大效率最高，之後放大效率逐漸下降。放大強度和信噪比：圖e顯示了在500次循環放大中的信号強度和信噪比。結果表明，與未放大的對照相比，500次循環放大可實作13倍的放大強度和6倍的信噪比增強。分支放大：圖f展示了通過引入分支引物(a*-T-a*-b)進行進一步的信号增強。通過額外的熱循環，分支放大顯著增加了探測位點的數量，與線性放大相比，50次熱循環分支放大可進一步實作9倍的信号增強，二次分支放大可實作額外5倍的信号增加，總計可實作500倍的初始信号放大。正交性驗證：圖g和h展示了ACE放大體系中33個引物序列的正交性驗證。通過對GFP抗體标記的HEK293T細胞進行單獨染色、條形碼标記和混合處理後，結果顯示33個引物序列之間的平均串擾信号僅為1.02%，驗證了ACE引物和探測器的高度特異性和正交性。
EMT和MET過程中的應用通過使用ACE技術對小鼠乳腺癌Py2T細胞模型進行分析，研究團隊能夠高靈敏度地檢測到在EMT和MET過程中發生的分子重程式設計。Zeb1和Snail/Slug表達變化：在EMT過程中，Zeb1的表達在第6天後急劇增加，而Snail/Slug的水準在最初的3天内緩慢下降，并在第6天出現次級峰值。細胞表型變化：在TGFβ1處理期間，上皮标志物E-cadherin、CK14、EpCAM和β-catenin的表達下降，間充質标志物vimentin和CD44的表達增加。相反，在TGFβ1去除後，這些标志物的表達發生逆轉。
多重ACE技術在上皮-間充質轉化(EMT)和間充質-上皮轉化(MET)過程中，由不同轉錄因子表達水準引起的分子調控的分析結果（Credit: Nature Biotechnology）
實驗流程：圖a展示了實驗的整體設計和流程。小鼠乳腺癌Py2T細胞被轉化生長因子β1(TGFβ1)處理14天以誘導EMT，然後去除TGFβ1進行14天的MET逆轉過程。在不同的時間點(0、1、2、3、6、9、14、17、21、24、28天)收集細胞，進行ACE标記和質譜分析。降維分析：圖b和c展示了使用統一流形逼近和投影(UMAP)方法對資料進行降維分析的結果。圖b根據處理時間點對細胞進行顔色編碼，圖c根據測量标志物的豐度對細胞進行顔色編碼。這些圖顯示了EMT和MET過程中細胞表型和分子特征的變化。僞時間分析：圖d展示了使用Scorpius僞時間分析方法對EMT-MET過程進行重構的結果。圖中将僞時間與實際時間進行比較，發現分子定義的間充質表型在第6天開始出現，在TGFβ1刺激後9天完全消失。在MET過程中，具有上皮分子特性的細胞群體在14天的時間序列中逐漸擴充，而大部分細胞保持其間充質狀态。分子調控軌迹：圖e展示了通過Scorpius分析測量标志物在EMT和MET過程中的分子調控軌迹。結果顯示，Zeb1表達的增加發生在EMT後期，伴随着CK14的下調。在反向MET過程中，Zeb1表達的下降與波形蛋白(vimentin)表達的急劇下降相關，而E-cadherin水準的上升則在之前發生。細胞群體特征：圖f展示了在MET過程中，不同時間點Zeb1高表達、cyclin B1低表達的細胞群體與Zeb1低表達、cyclin B1高表達的細胞群體的雙軸圖。結果顯示，Zeb1低表達、cyclin B1高表達的細胞群體在MET過程中逐漸增加。标志物表達水準：圖g展示了在Zeb1高表達、cyclin B1低表達的細胞群體與Zeb1低表達、cyclin B1高表達的細胞群體中，波形蛋白(vimentin)、E-cadherin和CK14的表達水準。結果表明，Zeb1和cyclin B1的表達水準與細胞的表型特征密切相關。
人T淋巴細胞信号網絡的分析通過ACE技術，研究團隊能夠高靈敏度地分析人T淋巴細胞信号網絡的動态變化：TCR信号傳導：在抗CD3/抗CD28刺激下，TCR信号傳導途徑中的關鍵磷酸化位點(如p-CD3ζ, p-ZAP70, p-SLP76, p-ERK1/2)的信号顯著增強，顯示出強烈的信号傳導響應。免疫抑制分析：通過與手術後引流液(postoperative drainage fluid, POF)共同培養，發現POF1和POF2樣品共培養導緻TCR信号響應的減少和更短暫，說明這些樣品具有免疫抑制特性。
多參數組織成像ACE技術與成像質譜細胞術(IMC)結合，使得多參數組織成像分析成為可能：腎髒組織分析：在對多囊腎病(polycystic kidney disease)患者的腎髒皮質組織進行分析時，ACE技術揭示了腎髒皮質中的六個主要區室，并展示了幹細胞标志物nestin在這些區室中的異質性表達。組織區室鑒定：通過IMC分析，能夠識别和區分不同類型的腎小管、腎小球和血管區室，提供了詳細的組織結構資訊。
ACE技術通過顯著提高質譜細胞術的靈敏度，為單細胞水準上低豐度蛋白質組分的分析提供了強有力的工具。這不僅拓展了質譜細胞術在生命科學研究中的應用潛力，還為相關疾病的研究和診斷提供了重要的技術支援。通過高靈敏度的多參數分析，ACE技術使得在單細胞層面上繪制低豐度蛋白質組分的圖譜成為可能，為科學研究提供了新的視角和方法。
參考文獻
Lun XK, Sheng K, Yu X, Lam CY, Gowri G, Serrata M, Zhai Y, Su H, Luan J, Kim Y, Ingber DE, Jackson HW, Yaffe MB, Yin P. Signal amplification by cyclic extension enables high-sensitivity single-cell mass cytometry. Nat Biotechnol. 2024 Jul 29. doi: 10.1038/s41587-024-02316-x. Epub ahead of print. PMID: 39075149.https://www.nature.com/articles/s41587-024-02316-x
責編|探索君
排版|探索君
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