2022年10月10日中国电子科技大学生命科学与技术学院信息生物学中心与澳大利亚悉尼大学植物育种研究所生命与环境科学学院在Frontiers上发表了题为“Molecular and cytogenetic dissection of stripe rust resistance gene Yr83 from rye 6R and generation of resistant germplasm in wheat breeding”的研究论文。该研究中黑麦6R衍生的条锈病抗性基因Yr83在小麦背景中通过非变性荧光原位杂交（ND-FISH）、寡核苷酸FISH染色和6R特异性PCR标记被物理定位在长臂的FL 0.87-1.00区域。该基因对澳大利亚和中国的小麦条锈病菌株均表现出高度抗性。
一、四川小麦背景的Sub6R（6D）及其衍生系的6R核型分析
研究人员通过多色FISH（mc-FISH）和基因组原位杂交（GISH）对来自Triticale T-701和Sub6R(6D)的6R染色体进行了表征。在本研究中，使用探针Oligo-Ku的非变性FISH（ND-FISH）代替GISH来识别Sub6R(6D)中的黑麦染色体6R。使用探针Oligo-pSc119.2和Oligo-pSc200的ND-FISH生成了6R的标准核型。6R的短臂在端部和亚端部区域分别携带一个强和一个弱的pSc119.2位点，在远端区域携带一个强的Oligo-pSc200位点。6R长臂有四个Oligo-pSc119.2和两个Oligo-pSc200信号位点，其中Oligo-pSc200杂交位点位于间质和亚端部的Oligo-pSc119.2位点之间。
Li等人使用黑麦基因组DNA作为探针，通过GISH观察到6RL上的两个强杂交带。基于GISH带型和FISH模式的比较，6RL上的两个GISH带与Oligo-pSc200杂交位点的物理位置相同。从Sub6R(6D)与MY11的BC1F4代中选择了一个含有6DS.6RL易位的R23系。此外，开发了一种新的ND-FISH探针Oligo-248，它在T-701、Sub6R(6D)和R23系的6RL端部区域产生特异性杂交位点。更新后的6R ND-FISH核型将有助于在后代或突变系中表征6R染色体特别是6RL的远端的结构变异。
图1 不同小麦背景下6R染色体的ND-FISH核型分析
为了将黑麦6R染色体片段转移到四川小麦背景中，共筛选了908株Sub6R(6D)和四川小麦CM42及MY11的F3代，使用探针Oligo-pSc119.2和Oligo-pSc200进行非变性荧光原位杂交（ND-FISH）。在BC1F3代中，以CM42和MY11为背景分别产生了带有一对6R染色体的R323和R476系。在F4代中，识别出了端粒染色体6RS和6RL，同工染色体iso6RS和iso6RL。此外，25株（2.7%）存在不同的小麦-6R易位，包括T1DS.6RL、T2DS.6RL、T6DS.6RL、T6BS.6RL和T6RS.6DL，表明6R与小麦染色体之间发生了高频率的断裂和再融合。开发了一个纯合的T6DS.6RL易位系R23。使用禾草常见着丝粒重复序列Oligo-CCS1和黑麦特异性着丝粒重复序列Oligo-pAWRC1.1探针进行ND-FISH，结果表明R23系含有来自小麦6D和黑麦6R的重组着丝粒，基于使用这两个探针的信号强度不同。R476品系显示出比亲本MY11早7-10天开花，植株高度降低到80-90厘米，穗长显著增加，此外还保留了来自6RL的条锈病抗性，表明“Merced”来源的6R对小麦背景中的农艺性状和抗锈病性状有积极影响。
图2 序列ND-FISH分析分析结果
二、新的6R缺失和易位系的鉴定
为了进一步定位Yr83基因，共筛选了1,662株来自195个M2:3家系的γ射线辐照Sub6R(6D)系的M3代植物，使用探针Oligo-pSc119.2、Oligo-pTa535和Oligo-pSc200进行非变性荧光原位杂交（ND-FISH）。大约4.0%的植物含有修改后的6R染色体，包括缺失、端粒或等端粒6R，以及小麦-6R易位染色体。基于6R的标准核型，通过使用Oligo-pSc119.2和Oligo-pSc200的FISH检测到6RL的三种类型的缺失。6R-1型在6RL的末端显示出最远端Oligo-pSc119.2位点的缺失，估计断裂点在6RL的FL 0.87处。6R-2型是6RL远端的较大缺失，断裂点在第二个Oligo-pSc200位点之后，估计断裂点在FL 0.82，缺失段为FL 0.82-1.00。6R-3型的缺失比6R-2型更大，断裂点在两个Oligo-pSc200位点之间。从Sub6R(6D)/CS ph1b突变体Schomburgk/6R缺失的杂交后代中开发了一个T6AL.6RLdel系，通过使用Oligo-pSc200、Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2的ND-FISH对其进行了表征。断裂点位于6RL上的两个Oligo-pSc200位点之间，类似于6R-3型的FL 0.73。
图3 Sub6R(6D)系辐照子代小麦-黑麦6R系的ND-FISH
使用探针Oligo-k288或Oligo-D和Oligo-Ku，以及Oligo-pSc119.2和Oligo-pTa535进行连续ND-FISH，以检测小麦和6R染色体之间的断裂点。探针Oligo-k288特异性地与A和B基因组染色体杂交，而Oligo-D特异性地与D基因组染色体杂交。在0.06%的植物中观察到两个涉及7A-6R和7D-6R的罗伯逊易位，而在2.13%的植物中检测到12种非罗伯逊小麦-6R易位。6RS的FL 0.50处以及6RL的FL0.50和FL 0.73处的断裂点在非罗伯逊易位中发生频率最高。
表1 寡核苷酸探针在ND-FISH染色体鉴定中的应用
三、通过PCR标记确认6RL缺失上的断点
使用了190个PLUG标记、321个CINAU标记和190个Kustro黑麦6RL的特异标记来扩增小麦品系MY11、Sub6R(6D)、T6DS.6RL、R266、R76和R367的DNA。此外，根据Lo7 6RL参考基因组序列的位置设计了16个6RL特异性引物。R266和T6AL.6RL22的断点通过标记Ku-6RL142和Ku-6RL112定位在720.56-723.16 Mb区域。R76的断点通过标记Ku-6RL416和Ku-6RL912定位在784.09-786.82 Mb区域。R367的断裂点通过标记Ku-6RL17和SC-6RL072定位在806.17-807.21 Mb区域。在6RL的远端区域，标记SC-6RL082到SC-6RL087在Sub6R(6D)中未能扩增，但在CS-Imperial 6R中扩增。这表明当前的6R可能在6RL的末端丢失了882-885 Mb区域，或者可能这两个黑麦品种在该区域高度分化。需要进一步研究探针Oligo-248在ND-FISH中的独特杂交与6RL 882-885 Mb区域明显丢失之间的关联。对应Lo7的参考基因组，R367中的缺失大约为6RL的75 Mb（806-881 Mb）。
图4 Sub6R(6D)染色体特异性标记的物理位置
表2 用于Sub6R(6D)的6RL特异性标记物
使用探针Oligo-pSc119.2和Oligo-pTa535对Sub6R(6D)系和T6DS.6RL易位系R23进行ND-FISH分析，然后用大量Synt6和Synt7的oligo探针进行FISH绘图。Synt6的FISH绘图显示，整个6RS和6RL的近端区域有明显的信号，表明它们与小麦第6组染色体具有同源性。通过使用探针Oligo-pSc119.2和Oligo-pTa535的ND-FISH比较6RL的核型，发现两个Oligo-pSc119.2位点的串联重复序列定位可能在Sub6R(6D)和R23的6RL的Synt7区域。使用探针Synt7在6RL的远端区域（大约FL 0.82-1.00）杂交的FISH图谱，表明该区域与小麦第7组染色体具有同源性。
图5 Sub6R(6D) (A, B)和R23 (C, D)的ND-FISH和Oligo-FISH图谱
四、Yr83的条锈病抗性及物理定位
在田间接种Pst混合小种CYR32、CYR33和CYR34后，小麦亲本CM42和MY11易感，品系Sub6R(6D)和T6DS.6RL品系R23具有抗性。纯合子6RL缺失系R266、R76和R367在成株期感病。结果表明，6RL的抗条锈病基因Yr83位于FL0.87 ~ 1.00，对应于Lo7的黑麦基因组806.26 ~ 881.00 Mb区域。
小麦族多组学网站：http://wheatomics.sdau.edu.cn投稿、合作等邮箱：[email protected]