小麦生产受到白粉病、锈病、赤霉病等多种真菌性病害的威胁，从小麦及其亲缘物种中发掘和利用有效的抗病基因对控制病害具有重要意义。高大山羊草（Aegilops longissima，2n = 14，SlSl）是小麦族山羊草属二倍体物种，与小麦的B基因组祖先高度相关，它能抵御小麦多种病害，是小麦遗传改良的重要资源。从20世纪80年代开始，Ceoloni、Cenci、Donini等人将高大山羊草的白粉病抗性导入小麦，创制了一系列小麦-高大山羊草易位系。后来，高大山羊草的这个抗白粉病位点被命名为Pm13。Pm13是已报道的抗白粉病基因中仍保持良好抗性的基因之一，且携带Pm13的易位系没有明显的连锁累赘，然而它在小麦抗病育种中受到的关注不多。本研究利用辐照诱导的感病缺失系对Pm13进行物理定位，利用EMS诱导的感病突变体进行转录组测序分析，鉴定和克隆了Pm13基因，经瞬时表达和转基因分析验证了它的抗白粉病功能。本研究还利用烟草和小麦叶片原生质体瞬时表达技术揭示了Pm13编码的新型融合蛋白的生化功能。
（1）携带Pm13的易位系对108个白粉菌菌株具有良好抗性
No.3778为携带Pm13基因的小麦-高大山羊草易位系，我们采用ND-FISH技术对携带Pm13的易位系No.3778的染色体组成进行鉴定，证实No.3778携带一对易位染色体3SlS-3BS.3BL，其中外源片段3SlS位于小麦染色体3BS的末端（图1a）。随后检测了该易位系对108个白粉菌菌株（包括101个来自中国的菌株和7个来自欧洲的菌株）的抗性反应，结果表明，一叶期的No.3778（Pm13）对测试的所有菌株都表现为免疫（IT 0）（图1b）。在2019-2022年小麦生长季节，田间种植的No.3778对强毒菌株Bgt YZ01具有良好的成株抗性。
图1 广谱抗白粉病基因Pm13的物理作图（2）Pm13的遗传分析 将抗病的No.3778（Pm13，IT 0）与感病的徐麦44（XM44，IT 4）杂交，构建遗传作图群体。抗病性鉴定显示，F1的反应型为IT 1，F2群体中238株分离出182个抗病单株（IT 0或1）和56个感病单株（IT 4），符合3:1的分离比例，说明No.3778对Bgt YZ01的苗期抗性由一个不完全显性基因控制（可能受基因剂量的影响）。 根据3SlS染色体末端0-22 Mb区域中的单拷贝或低拷贝的高大山羊草基因开发了37个多态性分子标记，其中4个为共显性分子标记（X1650、X3140、X3990和X5730），跨越16 Mb的范围，利用这4个标记进行遗传分析，在F2群体中没有检测到3SlS染色体和小麦3BS染色体之间的交换事件，这说明Pm13所在区域存在交换抑制，这限制了图位克隆技术的应用。（3）利用辐射诱导的染色体缺失对Pm13进行物理定位 利用60Co-γ射线辐照No.3778种子，从424个M2家系中鉴定出10个感白粉病突变体（m1-m10）（图1c）。用开发的37个分子标记对这些感病突变体进行分析，发现了8种类型的染色体结构变异，代表着不同大小的染色体片段缺失。在m1-m3中，所有标记都没有扩增产物，表明3SlS的整体缺失。m4和m5在近端分别存在不同大小3SlS染色体片段缺失，染色体断点两侧的标记分别为X2410/X2250和X2150/X2250。m7-m10在3SlS远端存在片段缺失，断点两侧的标记分别为X4150/X4220、X3940/X3990、X3410/X3940和X2770/X2820。突变体m6的染色体缺失范围在分子标记X2020/X2150和X4150/X4220之间（图1d）。综上，Pm13被定位到分子标记X2410和X2820之间，物理距离约为0.74 Mb。（4）利用EMS诱导的感病突变体进行转录组测序分析，鉴定MLKL-K为Pm13候选基因 使用EMS处理No.3778种子，收获了326个M2家系，从中筛选到6个抗白粉病功能丧失突变体（m11-m16）。Bgt YZ01接种后，对野生型（WT）No.3778和6个突变体的叶片进行转录组测序，将突变体的reads映射到野生型No.3778的转录组组装，鉴定到了一个2006 bp的转录本，命名为NODE_25350_length_2006_cov_24.294361_g11779_i0（简称为NODE_25350），它在5个突变体中含有EMS型点突变（G>A或C>T）（图2a）。
图2 Pm13候选基因的鉴定与功能验证
在高大山羊草参考基因组AEG-6782-2和TL05中都未发现与NODE_25350对应的注释基因。然而，在AEG-6782-2中，一个未组装序列（chrUn:3,336,888–3,345,975 bp）与NODE_25350高度同源，核苷酸序列一致性高达98.7%。根据NODE_25350开发了分子标记XMLKL-K，它在野生型No.3778中有特异性扩增产物，而在感白粉病突变体m1-m10中没有，这表明，NODE_25350位于Pm13所在的物理区间。 基于NODE_25350和含S基因组的山羊草属物种的保守序列设计引物，从No.3778中分离到一个11376 bp基因组片段（OR052510），它包含了2637 bp启动子、由7个外显子和6个内含子组成的6554 bp编码区和1932 bp终止子。对No.3778的cDNA进行RT-PCR扩增和Sanger测序，发现所得序列与NODE_25350完全一致。NODE_25350的开放阅读框（ORF）为1431 bp，编码476个氨基酸。编码蛋白包含一个N-末端的混合谱系激酶结构域样假激酶（Mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL_NTD）结构域和一个C-末端的丝氨酸/苏氨酸激酶（Serine/threonine kinase，STK）结构域，因而将候选基因命名为MLKL-K。通过Sanger测序验证了5个EMS诱导的感病突变体的MLKL-K激酶结构域中都存在单个氨基酸替换（m11：G401D、m12：G308E、m13：G231R、m15：P461L和m16：C334R）（图2b），而m14中MLKL-K的CDS没有发生变异，其抗白粉病功能丧失可能和调控区或其他与Pm13抗性相关的基因的突变有关。（5）瞬时表达和稳定的转基因分析证实MLKL-K具有白粉病抗性
为了验证MLKL-K的功能，构建了由Ubi启动子驱动的pUBI-MLKL-KCDS超表达载体，分别以含有Pm21的表达载体和空载体作为阳性对照和阴性对照，使用基因枪法将重组质粒和报告载体pUBI:GUS的混合物共转化到感病小麦XM44叶片中。在轰击后4小时用白粉菌菌株E09接种叶片，并在48小时后用GUS溶液染色，统计吸器指数。结果表明，在XM44表皮细胞中瞬时表达MLKL-K的吸器指数为36.8%，显著低于空载体对照（67.5%），而表达Pm21的阳性对照的吸器指数为33.7%（图2c-2d）。这说明MLKL-K的瞬时超表达在抵御小麦白粉菌的侵染过程中发挥了作用。
为了进一步验证MLKL-K的抗白粉病功能，构建了含有自身启动子和终止子的转基因载体pLGY-03-MLKL-K，然后使用农杆菌介导法转化高感白粉病的小麦品种Fielder，共获得了7个独立的MLKL-K阳性转基因植株。使用分子标记XMLKL-K进行检测，7个T0转基因植株都含有MLKL-K。用Bgt YZ01进行接菌鉴定，转基因植株都表现出免疫反应。衍生的7个T1家系，在接种Bgt YZ01后表现出抗、感分离（图2e-2f）。分子标记分析表明，MLKL-K存在与否与植株的抗感表型是吻合的。此外，还对2个T1家系中的阳性植株进行抗谱分析，它们对20个白粉菌菌株都具有高度抗性。由此得出结论，MLKL-K就是目的基因Pm13。初步观察表明，Pm13的表达对转基因植株的生长发育没有明显的负效应（图3）。
图3 Pm13转基因植株（6）烟草和小麦原生质体生化分析揭示了MLKL-K处于失活的自抑制状态 在烟草和小麦原生质体中的亚细胞定位分析表明，MLKL-K主要在细胞质和细胞核中积累（图4）。用生长一周的No.3778和感病对照XM44接种白粉菌菌株E09，48小时后进行DAB染色和台盼蓝染色，结果发现，No.3778表皮细胞在白粉菌侵染位点出现明显的H2O2的积累和细胞死亡现象（图5），这意味着MLKL-K可以通过激活H2O2的积累、引发宿主细胞死亡来阻止白粉菌的定殖。
图4 MLKL-K的亚细胞定位
图5 MLKL-K在白粉菌诱导的小麦叶片中引发H2O2积累和细胞死亡 为了在生化水平上研究MLKL-K的抗性机制，首先使用AlphaFold v2.0来预测MLKL-K编码蛋白质的三维结构。该蛋白含有一个由四螺旋束（four-helix bundle，4HB）组成的N-末端MLKL_NTD结构域，一个起连接作用的含3个α螺旋的支架环（Brace）和一个C-末端丝氨酸/苏氨酸激酶（STK）结构域（图6a）。接着构建了含有全长MLKL-K和不同截断短片段的载体，转入农杆菌后分别注射到本氏烟草叶片中，随后进行台盼蓝染色观察。研究发现，只有Brace-kinase122-476能够导致强烈的细胞死亡，而全长蛋白和单独的结构域或区段都不能引起细胞死亡。作为对照，Brace-kinase122-476D367A（突变位点在激酶的ATP结合口袋）不能引起细胞死亡（图6b-6d）。同样，5个EMS诱导的感病突变体中的变异Brace-Kinase122-476（G231R、G308E、C334Y、G401D和P461L）也不能引发细胞死亡（图7）。这些结果表明，Brace-kinase122-476诱导的细胞死亡依赖于功能性激酶结构域，并与它对小麦白粉病的抗性有关。
图6 Pm13编码的MLKL-K的结构与功能分析
图7 MLKL-K的突变导致丧失细胞死亡活性 通过烟草实验发现细胞死亡强度可能与Brace区的α螺旋的数目有关。接下来利用小麦原生质体瞬时表达技术对细胞死亡强度进行了定量分析，结果表明，含有3个α螺旋的激酶结构域（α1-α2-α3-kinase160-476）诱导的细胞死亡水平与Brace-kinase122-476相当，且显著高于含有2个α螺旋的激酶结构域（α2-α3-kinase174-476），而只有1个α螺旋的激酶结构域（α3-kinase194-476）丧失了引发细胞死亡的能力（图6d-6e）。这些结果表明，MLKL-K介导的细胞死亡不仅与功能性激酶结构域有关，也与Brace区的3个螺旋有关。激酶的活化通常依赖于自身的二聚化和磷酸化，Brace区的3个螺旋可能会促进MLKL-K激酶结构域的二聚化和活化。在缺少病原菌的情况下，全长MLKL-K不能诱导细胞死亡，这表明MLKL_NTD结构域可能阻止激酶结构域的二聚化并维持失活状态。
Pm13/MLKL-K与拟南芥、动物MLKL蛋白具有类似的结构：MLKL-Brace-Kinase。但是，Pm13的MLKL_NTD与拟南芥的MLKL并无明显的同源性，且分别属于MLKL_NTD（CCD cd21037）、DUF1221（CCD cl06017）这两个不同的保守域。拟南芥和动物MLKL蛋白都是假激酶，拟南芥的MLKL-Brace负责执行细胞死亡功能，小鼠的MLKL结构域能单独引发细胞死亡。与之不同的是，Pm13/MLKL-K是真激酶，由具有N端α螺旋的激酶结构域负责执行细胞死亡功能，MLKL_NTD和MLKL-Brace都不会激起细胞死亡。由此可见，Pm13编码的MLKL-K在结构和功能上都具有独特性。
（7）MLKL-K/Pm13起源于最近的激酶和MLKL_NTD结构域的融合事件 利用MLKL-K/Pm13的MLKL_NTD结构域的氨基酸序列，对小麦族物种和其他植物的蛋白质组进行BLAST分析，并通过NCBI保守结构域的搜索对匹配的蛋白质进行注释。我们发现植物界存在多种类型的含有MLKL_NTD的蛋白质。MLKL_NTD-PLAC8（MLKL_NTD与PLAC8结构域融合）是植物中最常见的类型，广泛分布于裸子植物、双子叶植物和单子叶植物中。只有在禾本科植物中，我们发现了其他类型的含有MLKL_NTD结构域的蛋白质，包括含有单个MLKL_NTD结构域或两个串联MLKL_NTD结构域的蛋白质、MLKL_NTD融合STK（MLKL-K-like蛋白）、WD40、BRX、NLR等结构域的蛋白质。这表明了禾本科植物中含有MLKL_NTD结构域的蛋白质的快速进化。此外还发现，MLKL-K-like蛋白家族可能已经扩展并成为小麦族中包含MLKL_NTD结构域的蛋白的主要类型（每个物种包含11至34个成员）。基于激酶结构域的系统发育分析表明，MLKL-K-like蛋白聚集在3个不同的分支中，表明在禾本科植物的进化过程中，激酶与MLKL_NTD结构域的融合至少独立发生了3次。作为一次融合事件，MLKL-K/Pm13及其直系同源物仅在含S基因组的山羊草属物种中发现，它们都是由S基因组中的单拷贝基因编码，而其他两个融合事件出现在不同的禾本科植物中（图8）。这些表明MLKL-K/Pm13及其直系同源基因起源于一个相对较新的kinase-MLKL_NTD融合事件。
图8 Pm13编码的MLKL-K起源于新的kinase-MLKL_NTD融合事件 总结而言，这项研究成功克隆了来源于高大山羊草的广谱抗白粉病基因Pm13，并揭示了其编码的激酶融合蛋白的生化功能和进化特性，有助于促进Pm13在小麦抗白粉病育种中的应用，也为进一步解析Pm13介导的白粉病抗性的分子机理奠定了基础。 2024年8月2日，上述研究成果以“A kinase fusion protein from Aegilops longissima confers resistance to wheat powdery mildew”为题发表于《Nature Communications》杂志。江苏大学何华纲副教授为第一作者兼通讯作者，研究生陈昭昭为共同第一作者，中国科学院分子植物科学卓越创新中心王亚军研究员为共同通讯作者。中国科学院遗传与发育生物学研究所沈前华研究员课题组、四川农业科学院张洁研究员、江苏大学朱姗颖副教授、河南大学高安礼副教授、湖北省农业科学院龚双军研究员、中国农业科学院李洪杰研究员、沙特阿卜杜拉国王科技大学Simon G. Krattinger教授等参与了该研究。这项研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金面上等项目资助。
文章链接：Huagang He, Zhaozhao Chen, Renchun Fan, Jie Zhang, Shanying Zhu, Jiale Wang, Qianyuan Zhang, Anli Gao, Shuangjun Gong, Lu Zhang, Yanan Li, Yitong Zhao, Simon G. Krattinger, Qian-Hua Shen, Hongjie Li & Yajun Wang. A kinase fusion protein from Aegilops longissima confers resistance to wheat powdery mildew. Nature Communications. 2024, 15: 6512.
http://www.nature.com/articles/s41467-024-50909-6
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