膽汁淤積症（CT）是以膽汁流量顯著減少為典型特征的臨床現象，在肝膽系統的診療實踐中構成了亟待解決的重大難題。有研究表明焦亡在肝損傷過程中扮演着至關重要的角色，這些研究不僅突出了NLRP3受體在膽汁淤積誘發的發炎調控中的核心地位，還進一步将焦亡與發炎反應之間建立了緊密的分子聯系。與此同時，一系列并行展開的研究亦有力地論證了焦亡在CT病情進展中的決定性作用。
芍藥苷（PF），作為一種源自芍藥屬植物的生物活性天然化合物，已在多種肝髒疾病的治療中展現出顯著的保肝效果。研究表明，PF不僅在治療對乙酰氨基酚誘導的肝損傷方面展現出治療優勢，還具備調節膽汁酸代謝的潛力。現有研究進一步揭示，PF不僅能夠促進膽汁酸的分泌，還顯著增強了膽汁酸的運輸與代謝過程。然而，關于PF是否通過精确靶向NLRP3/GSDMD信号通路來實作其保肝與利膽的雙重作用，以及具體的治療靶點尚待明确。
近日，一篇題為“Paeoniflorin inhibited GSDMD to alleviate ANIT-induced cholestasis via pyroptosis signaling pathway”的研究論文，深入探讨了PF對ANIT誘導的CT的緩解作用。該研究在揭示PF治療潛力的同時，也為CT的治療提供了新的視角和政策。
圖1 論文首頁
PF改善了ANIT誘導的CT模型中的肝損傷
該研究成功建構了基于ANIT誘導的CT大鼠模型，并在此基礎上進行了深入研究（圖2A）。結果顯示，PF能夠顯著降低由ANIT誘導的ALT、AST水準升高，有效緩解肝損傷症狀。同時，PF還顯著降低了BA、TBIL和DBIL水準，以及ALP和γ-GT水準（圖2B-H），進一步證明了PF在減輕CT誘導的肝損傷方面的有效性。
此外，通過組織學觀察發現，PF治療組的大鼠肝髒中發炎細胞浸潤程度及膽管增生程度均明顯減少（圖2I），表明PF在改善肝髒發炎和膽管增生方面也具有積極作用。同時，體外實驗結果顯示，PF能夠顯著提高ANIT處理的HepG2細胞的活力（圖2K-L），但CCK-8檢測表明，PF濃度為30 μM或更低的濃度在體外48小時内對細胞活力沒有顯著影響（圖2J）。進一步支援了PF在保護肝細胞免受損傷方面的潛力。
圖2 PF改善了ANIT誘導的CT模型肝損傷
PF可能通過NLRP3通路改善ANIT誘導的焦亡
先前的研究已确鑿地證明，芍藥能夠經由NF-κB/NLRP3信号通路有效減輕ANIT所誘導的CT。作為主要活性成分的PF，在緩解CT方面展現出顯著的治療潛質。該研究通過繪制維恩圖，并建構了建構了藥物靶-疾病關系網絡(圖3A-B)，确定了CT的靶點。為了闡明這些關鍵靶點在PF的CT治療作用中的生物學功能，研究還進行了GO和KEGG通路富集分析（圖3D-E）。結果顯示，PF可能通過調控NLRP3介導的細胞焦亡途徑，進而減少ANIT誘發的CT（圖3F-J）。網絡藥理學分析揭示了高評分值的靶标中，NLRP3占據了核心位置。且對關鍵靶點的GO和KEGG通路富集分析，均強烈指向PF通過調整NLRP3依賴性的細胞焦亡機制來改善CT（圖3）。
圖3 PF通過NLRP3途徑改善ANIT誘導的焦亡
PF介導NLRP3/GSDMD通路改善ANIT誘導的焦亡
研究明确指出，PF可能經由NLRP3所介導的經典焦亡路徑，有效緩解由ANIT所誘導的CT。為了更深入地探究焦亡機制，研究采用了電子顯微鏡這一精密工具進行觀測，結果揭示，經PF處理的實驗組中，線粒體腫脹現象顯著減少（圖4A）。同時，PF治療還顯著減輕了模型組中觀察到的細胞腫脹狀況，細胞膜上原本明顯的孔洞以及衆多的水泡狀突起均有所緩解（圖4K）。
進一步地，通過Western Blot（WB）實驗，該研究發現在體内外實驗中，與對照組相比，模型組的NLRP3、GSDMD-N、ASC、Caspase 1 P20等關鍵蛋白的表達水準均呈現明顯上調趨勢（圖4B-P）。而PF的介入則顯著逆轉了這一現象，具體表現為上述蛋白表達水準的下調（圖4G-Q）。免疫組化分析顯示，模型組的融合區GSDMD陽性表達程度高于對照組，而PF處理顯著降低了GSDMD陽性表達的面積（圖4J）。這一發現為PF在緩解ANIT誘導CT過程中的作用機制提供了有力的實驗證據。
圖4 PF介導NLRP3/GSDMD通路改善ANIT誘導的焦亡
PF通過靶向GSDMD改善ANIT誘導的焦亡
随後，該研究深入探讨了PF對ANIT誘導細胞焦亡的分子抑制機制，運用蛋白晶片技術以精确篩選PF的直接作用靶标（圖5A-B）。結果顯示，PF與GSDMD展現出顯著的親和力（圖5C），這一發現暗示了PF可能通過直接結合GSDMD蛋白來抑制焦亡過程。為進一步驗證此假設，該研究實施了一系列包括分子對接、CETSA以及SPR等科學實驗（圖5D-F），結果一緻證明了PF與GSDMD之間存在直接的互相作用，可能會抑制焦亡。
圖5 PF通過靶向GSDMD改善ANIT誘導的焦亡
PF通過GSDMD抑制發炎因子的釋放
在焦亡信号傳導路徑中，細胞往往會累積大量的pro-IL-1β和pro-IL-18。為了将這些促炎因子轉化為活性形式，caspase-1的激活是不可或缺的。此外，caspase-1還負責裂解GSDMD，進而引發膜孔的形成。GSDMD的激活及其随後導緻的膜孔形成，加速了裂解後的活性發炎因子的迅速釋放，進而觸發局部或全身性的發炎反應。
為了定量pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18的表達，研究對大鼠血清、大鼠肝組織和細胞上清進行檢測。結果顯示，與對照組相比，模型組中發炎因子的表達顯著增加（P<0.01）。然而，體内和體外實驗均顯示，高劑量PF組（PF-H和10 μM）的pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18均顯著下調（P<0.01）（圖6A-D）。LDH水準的升高是焦亡現象的一個常見生物标志物，研究進一步發現模型組大鼠的血清和肝組織中LDH釋放量顯著增加，而PF治療則顯著逆轉了這一趨勢（圖6E-F）。綜上所述，這些結果暗示PF可能通過作用于GSDMD，進而減輕ANIT誘導的焦亡過程，并進而抑制下遊發炎因子的釋放（圖6G）。
圖6 PF通過GSDMD抑制發炎因子的釋放
結論
總之，PF給藥被證明能有效減輕由ANIT誘導的肝髒病理損害，顯著增強肝功能标志物的水準，并提升細胞活力。基于網絡藥理學的研究以及焦亡抑制劑的深入探索，PF可能通過調控NLRP3依賴性的焦亡途徑，進而實作對CT的緩解作用。
參考文獻：
Ma X, Zhang W, Chen Y, Hu Q, Wang Z, Jiang T, Zeng Y, Efferth T. Paeoniflorin inhibited GSDMD to alleviate ANIT-induced cholestasis via pyroptosis signaling pathway. Phytomedicine. 2024 Nov;134:156021. doi: 10.1016/j.phymed.2024.156021
來源：梅斯循證中醫藥